| 研究課題/領域番号 |
22K10155
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分57060:外科系歯学関連
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
仲川 洋介 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (00714875)
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| 研究分担者 |
森 英一朗 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (70803659)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2025年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2024年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
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| キーワード | PIKKファミリー / 口腔癌細胞 / DNA修復 / ATM / DNA-PK / ATR / 口腔がん / DNA repair / PIKK family / ATR経路 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
口腔がん細胞において、放射線照射、抗悪性腫瘍薬さらには温熱処理が引き起こすDNA障害のチェックポイント機構から増感効果をもたらす分子標的を検討した研究は少なくp53が関連するATMChk2-p53経路に関して検討した研究は散見するが、ATR-Chk1-Cdc25A経路に関して検討した研究は少ない。そこで、ATR-Chk1-Cdc25A経路を阻害剤やsiRNAにより阻害することで、放射線照射や既存の抗悪性腫瘍薬や温熱処理によってより効果的に細胞死を誘導できるのか否かの検討を行う。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、DNA修復に関与するPIKKファミリーが、がん治療で用いられる既存の抗悪性腫瘍薬や放射線治療や温熱治療などの効果を増大させる分子標的となり得るのか否かの検討を目的としている。
昨年度までに、口腔扁平上皮癌細動のSAS細胞およびHSC3細胞ともに、5-FU処理では ATR阻害剤の併用により著明な増感効果を認め、X線照射ではDNA-PK阻害剤との併用で増感効果を認め、温熱処理ではATR阻害剤との併用により高い増感効果を認める結果を得ていた。
今年度は、温熱処置とATR阻害剤の併用による増感効果のメカニズムの検討を行った。ウエスタンブロッティングにて温熱処理（44℃）の時間依存的に自己リン酸化が認められた。また、ATR阻害剤を組み合わせるとATRの自己リン酸化の抑制が認められた。
次に、ヒストンH2AXのリン酸化を免疫染色にて検出したところ、温熱処理（44℃・20分間）単独群では、処理後30分でヒストンH2AXのリン酸化の増加が認められ、12時間後、24時間後の細胞では、リン酸化が減少していた。温熱処理とATR阻害剤を組み合わせると、ヒストンH2AXのリン酸化は顕著に増加し、さらに12時間後、24時間後もそのリン酸化の程度は変化が認められなかった。さらに、Apoptosis誘導の増加をFlow cytometryを用いた細胞周期のヒストグラムおよびHoechst染色での形態学的変化から検討を行い、温熱処理単独に比べATR阻害剤併用ではApoptosis誘導を著明に増加させる結果を得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでATR阻害剤を用いることで温熱処理による殺細胞効果が上昇することから、、PIKKファミリノーの中でATRが温熱処理のターゲットになることを発見していた。
そこで、ウエスタンブロッティングにて温熱処理に伴うATRおよびATR関連のDNA修復経路のタンパク質の経時的な発現変化を比較し、ATR阻害剤を併用するとそれらの発現が抑えられることを確認した。γH2AX抗体を用いた免疫染色でDNA二本鎖切断の量的比較検討を行い、Flow cytometryを用いた細胞周期のヒストグラムおよびHoechst染色での形態学的変化からApoptosis誘導の検討を行ったところ、温熱処理単独に比べATR阻害剤と温熱処理を併用することで Apoptosis誘導を著明に増加させる結果を得た。
以上のように、温熱処理とATR阻害剤の併用による増感効果のメカニズムに関して少しずつ研究内容を深め解明していくことが出来ていると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
温熱処理とATR阻害剤併用による殺細胞効果の上昇に関してのメカニズムに関しては、研究が進んでおり、同じくATR阻害剤で殺細胞効果の上昇を認めた5－FUに関してもそのメカニズムの解明を進めていく予定にしている。
具体的には、ウエスタンブロッティングにて5-FUに伴うATRおよびATR関連のDNA修復経路のタンパク質の経時的な発現変化を比較し、ATR阻害剤を併用するとそれらの発現が抑えられることを確認する。γH2AX抗体を用いた免疫染色でDNA二本鎖切断の量的比較検討を行い、Flow cytometryを用いた細胞周期のヒストグラムおよびHoechst染色での形態学的変化からApoptosis誘導の検討い、5-FUのATR阻害剤併用による増感効果のメカニズムを検討していく予定である。
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