| 研究課題/領域番号 |
22K10209
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分57060:外科系歯学関連
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| 研究機関 | 福岡歯科大学 |
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研究代表者 |
古村 南夫 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 教授 (10315070)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)
2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
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| キーワード | 自己免疫水疱症 / バイオマーカー / ゲノム編集 / シングルセルRNAシークエンシング / 疾患バイオマーカー / 口腔粘膜 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
自己免疫水疱症抗原遺伝子をゲノム編集でノックアウトした粘膜／皮膚由来ケラチノサイトを構築し、最新鋭の次世代シーケンサーによるシングルセルRNAシークエンシングにて包括的RNAトランスクリプトーム解析する。患者血清や抗原特異的モノクローナルを添加後にmRNA・miRNA解析し自己免疫性水疱症の粘膜病変の分子病態を探索する。さらに、差次的に発現された患者血清miRNAをノックアウト細胞に導入後にmiRNA-mRNAペアリング法にて解析し、新規バイオマーカーにつながる手がかりを得たい。
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| 研究実績の概要 |
自己免疫水疱症の発症に関わる自己抗体が標的とする表皮細胞の細胞間結合蛋白抗原の遺伝子をゲノム編集でノックアウトしたケラチノサイトを構築した。３次元培養ケラチノサイトを対象にして、最新鋭の次世代シーケンサーによるシングルセルRNAシークエンシングにて包括的RNAトランスクリプトーム解析を行った。細胞間接着や細胞分化とのかかわり、天疱瘡の病態形成に関係するシグナル伝達機構などを中心に、解析を加える。
CRISPR/Cas9 システムを用いたゲノム編集により、自己免疫水疱症の抗原であるデスモグレイン３をノックアウトし、口腔粘膜3次元のケラチノサイト培養系を構築した。デスモグレイン3の発現消失とその影響について、蛍光抗体法や免疫ブロット法により確認した。デスモグレイン3のCas9-gRNAプラスミドは本学で既に作製されたものを用いた。自己免疫水疱症天疱瘡のもう一つの抗原であるデスモグレイン１のノックアウトについては確立できていないため、今後確立手段についてさらに検討を重ねる必要がある。
ノックアウト細胞は2次元および3次元培養にて、患者血清抗体やモノクローナル抗体を添加したものと無添加群を対照として、シングルセルRNAシーケンシングにてmRNAとmiRNA発現プロファイルを確認後、相互比較し包括的トランスクリプトーム解析を行う。必要なアウトソーシング解析に掛かる費用が高額であるため、今後さらに解析対象の絞り込みなど行いながら、研究を推進していく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ゲノム編集でノックアウト実験を行い、シングルセルRNAシークエンシングにて包括的RNAトランスクリプトーム解析を開始した。今後、デスモグレイン３ノックアウト細胞で得られたシングルセルすなわち構成する細胞ごとの遺伝子発現パターンが得られたため、細胞接着、細胞分化との関連性を中心に解析を進めていく予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
アウトソーシングで可能な解析法を含めて、シーケンシング結果の検討をさらに進める。今後の解析事項の重要性などを検討したうえで、再度必要ならば、シングルセルRNAシーケンシング解析を繰り返しながら研究を推進していく予定である。
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