| 研究課題/領域番号 |
22K10215
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分57060:外科系歯学関連
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| 研究機関 | 独立行政法人国立病院機構(名古屋医療センター臨床研究センター) |
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研究代表者 |
上嶋 伸知 独立行政法人国立病院機構(名古屋医療センター臨床研究センター), その他部局等, その他 (80877069)
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| 研究分担者 |
酒井 陽 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (80772425)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | 骨粗鬆症 / 細胞老化 / 細胞外小胞 / 乳歯歯髄幹細胞 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
近年，従来の医療技術では治療困難であった重篤な疾患や生活の質を損なっている疾患に対して，細胞外小胞（EVs）を用いたアプローチが注目されている。特に間葉系幹細胞は様々な細胞への分化能を持つ細胞であり，さらに細胞の増殖や分化に関する因子を放出するため，間葉系幹細胞を由来とするEVsを用いた治療効果が期待されている。
骨粗鬆症患者は増加傾向にあり，治療はビスフォスフォネート製剤などの薬物治療が主となっているが，顎骨壊死などの有害事象を起こし得る。
本研究では，分化能，増殖能の高い乳歯歯髄幹細胞を由来とするEVsに着目し，骨粗鬆症の骨質改善に対する効果を検証する。
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| 研究実績の概要 |
幹細胞由来のコンディショニングメディウム（CM）は，マウスにおいて骨粗鬆症の予防効果が実証されているがそのメカニズムは解明されていない。今回，卵巣摘除マウスモデルにおいて，幹細胞由来CMが幹細胞の老化に影響を与えることで骨粗鬆症を予防できるかどうかを検証した。
In vitroで，若い幹細胞由来のCMと老化した幹細胞のCMを採取，交換し幹細胞と共培養した後，細胞増殖アッセイ，ポリメラーゼ連鎖反応，老化関連酸性β-ガラクトシダーゼ染色を行った。次に骨粗鬆症に対するCMの効果を検証するため，C57BL/6Jマウスの卵巣摘除モデルを作成し，CMまたはPBSを投与した。16週後，大腿骨と椎体（L5）をマイクロコンピューター断層撮影で測定した。その後大腿骨を摘出し，細胞老化関連分泌形質およびサイクリン依存性キナーゼの発現を遺伝子レベルおよびタンパク質レベルで測定した。In vitroでは若い幹細胞由来CMは幹細胞の必須細胞機能を向上させ，細胞の老化を抑制した。一方，老化した幹細胞由来のCMは幹細胞の必須細胞機能を低下させ，細胞の老化を促進した。In vivoでは，CMの投与により骨吸収が緩和され，骨微小環境における幹細胞の老化の蓄積が抑制された。
以上より，細胞性老化幹細胞培地は幹細胞の機能を低下させ，骨粗鬆症の病態を抑制することが明らかとなった。しかし，具体的な分子メカニズムはまだ正確に解明されておらず、さらなる実験が必要である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
令和4年度は乳歯歯髄幹細胞が入手できなかった。
このため，商用の歯髄幹細胞を培養し，乳歯歯髄幹細胞で行う予定であった研究（培養上清からEVsの単離，表面抗原マーカーの確認，粒径計測，表面形状の観察）を予備実験として行い，それぞれの手技などを確認した。
また，幹細胞由来EVsが骨組織に取り込まれるかの確認にも時間がかかっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和5年度は乳歯歯髄幹細胞からのEVsの単離を行い，性状を確認する。また骨組織へのEVsの取り込みの確認を引き続き行う。
次に，卵巣摘除モデル（OVX）ラットより採取したMSCsの細胞老化ならびにEVsの影響を調べるため，OVXラットを作製し骨密度の減少を確認後，大腿骨骨髄を採取する。採取後培養したMSCsの細胞老化を老化関連酸性β-ガラクトシダーゼ染色，DNA損傷のマーカーとして用いられているγH2AXの免疫組織化学染色などを行いて確認する。
採取したMSCsとDDPSCs由来EVsを共培養し，MSCsの分化能，遊走能，増殖能を評価する。骨芽細胞，脂肪細胞，血管内皮細胞へ分化誘導しアリザリンレッドS染色，オイルレッドO染色，抗CD31抗体染色により評価する。またGap Closureアッセイで遊走能を，MTT試験で増殖能を評価する予定である。
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