| 研究課題/領域番号 |
22K10622
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分58040:法医学関連
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| 研究機関 | 久留米大学 |
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研究代表者 |
副島 美貴子 久留米大学, 医学部, 准教授 (80279140)
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| 研究分担者 |
神田 芳郎 久留米大学, 医学部, 教授 (90231307)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 敗血症診断 / 核酸増幅 / ethidium monoazide処理 / 液体培養 / viability PCR / 敗血症 / 法医解剖事例 / コンタミネーション / 細菌検査 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
法医領域で敗血症が疑われる事例にしばしば遭遇するが、死後変化の影響により敗血症を確実に診断することは難しい。臨床現場でゴールドスタンダードな検査である血液培養検査は、法医試料に特徴的な要因で、特定の細菌が分離、同定されても原因菌とは断定できないものの、同定された菌種の感染と解剖・検査所見との間に整合性が確認されるケースもあり、微生物の存在の証明は法医診断に有用である。本研究計画では、生細菌を選択的に増幅するPCR法を利用した増幅法や核酸抽出法の検討をおこない、敗血症原因菌の検索における核酸増幅の有用性について調べてみたい。
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| 研究実績の概要 |
本研究は、生細菌（生菌）を選択的に増幅するviability PCR法の利用や検体からの核酸の抽出法を比較検討することにより、腐敗やコンタミネーションなど、生体に由来するものとは状態が異なる検体を扱う法医領域での敗血症診断における原因菌の検索における核酸増幅の有用性を検証する目的で計画したものである。計画の2年目となる本年度では、核酸増幅のシステムが機能するかどうかを確認するために、解剖事例のサンプルについて検討をおこなった。培養検査で胸腔内液の培養検査により化膿レンサ球菌が分離培養され、解剖所見及び検査所見から化膿連鎖球菌による重症気管支炎及び胸膜炎が死因として診断された症例について、血液を試料とし一般的に用いられているキットを用いDNAを抽出し、細菌スクリーニング検査に続く同菌種に特異的なプライマーを用いたリアルタイムPCRをおこなった結果、増幅が確認された。今回は冷凍保存した血液が対象であったことから、死菌由来DNAをDNA修飾色素であるEMA (ethidium monoazide)によって修飾することによりPCR増幅を抑制し生菌由来DNAのみを検出できる方法を用いた生菌と死菌の分別PCRは実施することができなかったが、を菌種同定を目的としたDNA抽出方法と核酸増幅系がうまく働いていることを確認することが出来た。さらに血液中にも感染症原因菌の存在を認めたことから敗血症を発症していた可能性を示唆することが出来た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
遭遇する可能性の高い菌種について死菌/生菌の分別の条件を確立する予定であったが、EMA処理の条件検討に時間を要しており現在までにできていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
EMA処理の条件検討は継続するが、レジオネラ属菌の検出方法として、検体を18時間程度液体培養し生菌を選択的に増殖させてからEMA処理による死菌由来DNAからのPCR増幅の抑制、DNA抽出後、PCRによる検出を行う方法（LC EMA-qPCR法、LC：Liquid Culture）が開発されており、「迅速性」と「生菌選択性」を兼ね備えた遺伝子検査法であり、EMA-PCR法に比べ、より確実でかつ高感度な生菌検出法とされていることから、この方法も有用ではないかと考えている。これらの検討を行いながら、症例サンプルについても解析を行う予定である。
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