研究課題/領域番号 |
22K11805
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研究種目 |
基盤研究(C)
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配分区分 | 基金 |
応募区分 | 一般 |
審査区分 |
小区分59040:栄養学および健康科学関連
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研究機関 | 長崎大学 |
研究代表者 |
坂根 千春 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医歯薬学総合研究系), 助教 (40792578)
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研究分担者 |
小守 壽文 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (00252677)
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研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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キーワード | Runx2 / Galnt3 / Fgf23 / エンハンサー / 血中リン濃度制御 |
研究開始時の研究の概要 |
この研究では、血中のリン濃度を調節しているホルモンFGF23(遺伝子名Fgf23)と、その活性を維持している酵素 GalNAc-T3(遺伝子名Galnt3)の発現が、どのように制御されているかを調べる。FGF23は主に骨から産生され、骨形成に必須の転写因子Runx2を介して発現調節されている可能性がある。そこで、Runx2の結合領域を目印にGalnt3とFgf23の生理的発現に必要なエンハンサーを同定し、血中リン恒常性維持のための両遺伝子の転写レベルの制御機構を問う。その研究成果は、血中リン濃度の制御機構の解明に大きく貢献する。
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研究実績の概要 |
この研究では、血中のリン濃度を調節しているホルモンFGF23(遺伝子名Fgf23)と、その活性を維持している酵素GalNAc-T3(遺伝子名Galnt3)の発現が、どのように制御されているかを調べる。FGF23は主に骨から産生され、骨形成に必須の転写因子Runx2を介して発現調節されている可能性がある。また、Runx2が転写調節する遺伝子をマイクロアレイで網羅的に検索した結果、Galnt3がRunx2によって骨芽細胞でも発現誘導された。このとき、Fgf23は骨芽細胞でも強く発現していた。したがって、Galnt3がFGF23の活性を維持する経路で、Runx2がGalnt3の発現を誘導し、血中リン濃度の調節に関与している可能性が考えられた。そこで、Runx2の結合領域を目印にエンハンサーを探索し、in vivo実験によってGalnt3およびFgf23の生理的発現に必要なエンハンサーを決定する。 はじめに、9週齢のマウス大腿骨および脛骨から分画した骨芽細胞画分と骨細胞画分を用いて、real-time RT-PCR法により、Runx2とGalnt3およびFgf23の発現を調べた。Runx2とGalnt3は骨芽細胞画分で強く発現しており、Fgf23は骨細胞画分で強く発現していた。つぎに、初代培養したマウス骨芽細胞を用いたRunx2抗体によるChIPシークエンスおよびATACシークエンスによるオープンクロマチン領域検出の結果と、データベース上の種間の塩基配列ホモロジーから、Galnt3のエンハンサー候補を選定した。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初代培養したSp7陽性マウス骨芽細胞を用いたRunx2抗体によるChIPシークエンスおよびATACシークエンスによるオープンクロマチン領域検出の結果と、データベース上の種間の塩基配列ホモロジーから、Galnt3のエンハンサー候補を選定した。Fgf23は骨芽細胞よりも骨細胞でより強く発現していた。初代培養した骨芽細胞を用いたChIPシークエンスおよびATACシークエンスからFgf23周辺の領域にピークが得られたが、これが生理的発現に必要なエンハンサーかどうかよく検討する。また、Runx2抗体によるChIPシークエンスのために骨細胞を集める方法を検討する。 選定したGalnt3のエンハンサー候補については、今後の研究の推進方策に記載した方法で検討していく。
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今後の研究の推進方策 |
最小プロモーターを含むGFP発現ベクターにエンハンサー候補をそれぞれ挿入し、トランスジェニックマウスを作製する。3週齢で大腿骨の凍結切片を作製して蛍光顕微鏡観察によりGFP発現細胞を特定し、生理的発現パターンを再現できるエンハンサーを同定する。遺伝子工学試薬 、凍結組織切片作製用包埋剤等を購入する。マウス購入費とマウス維持費も必要となる。
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