DNA二重鎖切断修復過程の可視化によるゲノム変異生成メカニズムの解明

• 研究課題/領域番号: 22K12380
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分63020:放射線影響関連
• 研究機関: 国立研究開発法人国立がん研究センター
• 研究代表者: 柳原 晃弘 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 主任研究員 (70423051)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2026-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2024年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2023年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円); 2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
• キーワード: DNA修復 / DNA二重鎖切断 / ライブセルイメージング / 放射線

研究開始時の研究の概要

放射線の過度な被ばくは発がんのリスクを高めるが、放射線がどのようなメカニズムで発がんを誘導するのかについては不明な点も多い。現在広く受け入れられている仮説の一つは、放射線が遺伝情報物質であるDNAを切断し、その再結合に際して遺伝情報が変化してしまい、それが元となって細胞ががん化してしまうというものである。しかし、この一連の過程が実際に観察された例はこれまでなく、この仮説の確認には至っていない。本研究ではこの仮説の中の特に初期過程の立証に貢献すべく、放射線被ばく後、DNAの再結合によって遺伝情報が変化する瞬間をライブ観察で捉えることに挑戦する。

研究実績の概要

放射線はDNAの二重鎖を切断するが、細胞はそれを再結合する能力を持っている。しかし、必ずしも元通りに戻るわけではなく、誤った再結合が生じる場合もある。このような誤った修復によりゲノムに変異が生じると、それががん化につながる可能性もあるため、誤った修復による変異の生成メカニズムの解明は重要な課題である。本研究は、DNA二重鎖切断の修復過程でどのようにしてゲノム変異が生成されるのかを、ライブセルイメージングによる修復タンパク質とゲノムDNAのダイナミクス観察から明らかにしようとするものである。
DNA修復のダイナミクス解析を行うには、主要な修復経路、すなわち非相同末端再結合経路と相同組換え経路のタンパク質を可視化する必要がある。非相同末端再結合のタンパク質の可視化にはすでに成功していたため、相同組換えのタンパク質の可視化を行い、緑色蛍光によるライブセルイメージングの系を確立した。さらに、マイナー経路ではあるものの誤りがちな修復を行うとされている、マイクロホモロジー媒介末端結合経路のタンパク質も可視化した。これで、DNA二重鎖切断修復のダイナミクスを修復タンパク質の面から追跡する環境が整った。
ゲノム変異の生成、つまりゲノムDNAの変化を観察するため、CRISPRイメージングによるゲノムDNAの可視化を試みた。ゲノムの可視化は非リピート配列では難しく、リピート配列では比較的容易とされているため、まずテロメア反復配列を標的として可視化を行った。様々な試作品の作製と試行錯誤の結果、テロメアをライブセルイメージングでクリアに観察することが可能となった。ゲノム変異の可視化に向け、最終的には非リピート配列または低コピーリピート配列の可視化を目指すが、それに向けた基盤技術の確立が達成された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

解析に必要なツールと基礎的な技術がほぼ揃ったため。

今後の研究の推進方策

当初の研究計画に従って進める。