| 研究課題/領域番号 |
22K12787
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分90110:生体医工学関連
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
吉田 哲 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 特任講師 (00365438)
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| 研究分担者 |
畑 純一 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, 客員研究員 (00568868)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2024年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2022年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
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| キーワード | コネクトーム / MRI / トラクトグラフィー / 造影剤 / AAVベクター / ニューロン |
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| 研究開始時の研究の概要 |
脳は、ニューロンとよばれる細胞が神経回路を形成することにより、複雑な情報処理を行うことが可能になっている。現在、この神経回路をすべて明らかにすることが、脳研究の重要な命題となっている。MRIは、これを行うための非常に有用なツールであるが、ニューロンを直接観察できないため、現在は水分子の動きでニューロンの形体を推測している。本研究では、ニューロンにMRI造影剤を取り込む遺伝子を発現させることにより、その形体を直接観察する方法を確立する。
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| 研究実績の概要 |
近年、コネクトーム研究とよばれる、脳の神経回路の走行をすべて決定することにより、脳機能解析の礎とする研究が世界中で活発に行われている。この研究において、MRIをもちいてニューロン内部の水分子の動きを計測し、そのデータをもとに軸索走行を擬似的に可視化するトラクトグラフィーは強力なツールであるが、実際のニューロンの形態との比較は行われておらず、その正確性は証明されぬまま現在に至っている。そこで、本研究の目的は、トラクトグラフィーとニューロンの形態の比較を可能とするために、MRIをもちいてニューロンそのものの形態を計測する方法を確立することとする。
これまで、MRIをもちいてニューロンを観察できなかったのは、ニューロン特異的に取り込まれる造影剤が存在しなかったためである。本研究では、「造影剤を細胞に取り込ませる遺伝子」をニューロン特異的に発現させることにより、MRIによるニューロンの検出を可能にする。また、MRIでニューロンを可視化した脳は、その後、組織学的解析を行い、その正当性を評価する。そのために、「MRI造影剤を細胞に取り込ませる遺伝子」を発現させる細胞には、同時にGFPなどの遺伝学的マーカーを同時に発現させる。これら２つの遺伝子を発現するAAVベクターを作製し、マウスの脳にインジェクションし、その後、そのマウスに造影剤を投与した上でMRIで撮像し、そのマウスの脳を免疫組織学的に解析してどのニューロンに上記遺伝子が発現しているかを調べる。そして、MRI画像と免疫組織学的解析を行った画像を比較を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
申請者は、まず、MRI造影剤ガドリニウムを細胞内に取り込む陰イオントランスポーターSlco1a1遺伝子のクローニングを行った。次に、この遺伝子とGFPを同時に発現する発現ベクターを作製し、培養細胞にトランスフェクションし、その細胞にガドリニウムを加え、MRI撮像を行うことにより、GFPを発現する細胞がガドリニウムを取り込むことを確認した。
また、別のMRI造影剤SPIO（ビオチン化されたもの）を細胞表面に結合させることができる人工遺伝子として、「細胞表面エピトープ・ディスプレイシステム」を用いてストレプトアビジンを発現させることを計画していた。この遺伝子とGFPを両方発現するコンストラクトを作製し、培養細胞に豚ラスフェクションしたところ、細胞内にGFPの凝集体が形成されていた。タンパク質の高次構造形成の過程で、細胞外に出られなかったことが予想される。
そこで、本研究のこれ以降の実験は、ガドリニウム造影剤を使用した系のみ行うこととした。
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| 今後の研究の推進方策 |
MRI造影剤を取り込む遺伝子およびGFPを発現するコンストラクトを作製することができたので、これを発現するAAVベクターを作製し、マウスの脳にインジェクションする。このマウスに、MRI造影剤を投与し、MRI撮像を行い、ニューロンを可視化する条件を検討する。
MRIで直接ニューロンを可視化できる条件が整ったら、撮像後のマウスの脳を固定し、組織学的解析を行い、AAVベクターがインジェクションされた位置を検討する。このMRI画像と組織学的解析像を比較することにより、MRIが撮像したニューロンが本当にニューロンであるかどうかを検討する。
さらにMRIで撮像したニューロンとトラクトグラフィーを比較することにより、トラクトグラフィーの正当性を検討する。
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