研究課題/領域番号 |
22K14705
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研究種目 |
若手研究
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配分区分 | 基金 |
審査区分 |
小区分34020:分析化学関連
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研究機関 | 国立研究開発法人物質・材料研究機構 |
研究代表者 |
山本 翔太 国立研究開発法人物質・材料研究機構, 機能性材料研究拠点, 研究員 (10785075)
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研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2024-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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配分額 *注記 |
4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)
2023年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
2022年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
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キーワード | バイオ分析 / メカノバイオロジー / ゲノム編集 / バイオマテリアル / がん細胞 / 細胞足場材料 / 光制御 / 細胞応答 |
研究開始時の研究の概要 |
生体内の細胞は、組織から化学・力学的な刺激を絶えず受け続ける環境に存在している。そのため生命現象を正確に理解するためには、生体内の出来事を生体外で再現できる材料の開発とその実験系の構築が必要である。そこで本研究では外部からの刺激によって表面のリガンド密度(化学因子)や弾性率(力学因子)を制御可能な生体内を模倣した細胞培養足場材料を開発し、細胞移動や浸潤などの動態変化中における機能発現や消失過程をバイオ分析により解析し、生命現象を捉えることを目的とする。
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研究実績の概要 |
タンパク質の発現や局在、定量化など、分析対象として細胞を扱うバイオ分析の発展により、観測精度やハイスループット性が劇的に向上し、癌の早期検出や治療薬発見など医療分野に対して高い貢献を果たしている。しかしながら、次世代の分析技術が開発される流れとは逆行し、対象となる細胞は、未だにポリスチレンディッシュやハイドロゲルなどの静的な人工物で評価されている。これは生体内の細胞が、細胞外マトリックス環境から化学・力学的な刺激を動的に受け続けることを考慮すると、現在までに使用されている足場材料では生体内の現象を正確に捉えているとは言い難い。そこで本研究では、化学・力学特性を光で制御可能な足場材料を開発し、細胞の動態変化をバイオ分析することを目標としている。 初年度では、足場材料の力学特性を制御するため、ゲノム編集技術であるCRISPR-Casシステムを光機能化したツールの作製を行なった。まず既存のCRISPR-Casタンパク質を分割し、そこに光応答性分子を導入した光応答性CRISPR-Casを作製し、そのDNA切断効率を調べた。すると、開発した光応答性CRISPR-Casシステムは、光照射時において効率良くDNAを切断したのに対して、光照射を行わない状態ではほぼ活性を示さなかった。この結果より、開発したツールは光照射で活性を制御できることが示され、このタンパク質を用いることでハイドロゲルの架橋部位を切断し、弾性率を調節できることが示唆された。続いて、細胞足場材料の作製を行なった。アクリルアミドからなるハイドロゲルを作製し、条件検討を行うことで弾性率が対象とする臓器と同等になる足場材料が得られた。この材料の上で細胞を培養することで、これまでの報告通り弾性率に応じて細胞の接着挙動が変化することを確認した。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度は、生体内の細胞が基質から物理的な刺激を受け続けていることを念頭に、化学・力学特性を光で制御可能な足場材料を開発するためのツールを作製した。はじめに、ハイドロゲルの力学特性を制御するためのツールとして光応答性CRISPR-Casシステムの作製を行なった。まずCRISPR-Casを分割することで活性を失わせ、その分割箇所に光応答性分子を導入することで、光照射により活性を回復させる戦略で実験を実施した。すると、開発した光応答性CRISPR-Casは、光照射前の状態でDNA切断活性がコントロールサンプルと同程度であった。これは分割することによりCRISPR-Casの構造が変化し、予想通り不活性になっていることを示唆している。次に、この光応答性CRISPR-Casに光を照射すると、効率よくDNA切断が起きた。これは、光照射によって分割したCRISPR-Casタンパク質が、光応答性分子を介して元の構造に戻り、結果として活性が回復したことを強く示している。その後、Casタンパク質の分割位置を検討することで、最も効率の良い光応答性CRISPR-Casの作製に成功した。 続いて、細胞足場材料の作製を行うことを目的とし、アクリルアミドからなるハイドロゲルを作製した。モノマーおよび架橋剤濃度等の条件を検討することで、弾性率が5~50 kPaの範囲で2種類の足場材料が得られた。この材料の上で細胞を培養することで、これまでの報告通り弾性率に応じて細胞の接着挙動が変化することを確認できた。 以上のように今年度は、ハイドロゲル細胞足場材料の力学特性を制御するためのツールおよびその土台の作製に成功した。さらにバイオマテリアルやゲノム編集に関連する投稿論文も発表した。これらの理由から、本年度は期待通りの成果を挙げたため、進捗状況は「おおむね順調に進展している。」と評価できる。
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今後の研究の推進方策 |
今後の計画として、昨年度に開発した光応答性CRISPR-Casタンパク質とアクリルアミドゲルを組み合わせて光応答的にハイドロゲルの物理特性を変化させる細胞足場材料の開発を行う。具体的には、光応答性CRISPR-Casを封入し、表面にcRGDなどの細胞接着性分子を修飾したハイドロゲルを作製する。その後、細胞を培養し、光照射に伴う架橋点の切断により弾性率を変化させ、がん細胞の接着挙動や集団移動挙動、さらには細胞機能の変化を顕微鏡観察や免疫染色、ウエスタンブロッティング、RT-PCR測定により調査する。この一連の実験を経て、足場材料の作製から評価するまでの実験系を構築する。その後、より生体環境に近しい材料の作製を目的とし、ハイドロゲルの成分をアクリルアミドではなく、コラーゲンやヒアルロン酸など生体適合性の高い分子に変更し、ハイドロゲル足場材料の開発を目指す。このような材料で同様の実験が実施できれば、二次元培養だけではなく、三次元培養での検証も行うことができ、本研究プロジェクトで開発する足場材料の応用の幅が広がると考えている。将来的には、生体模倣型のこの足場材料を薬剤スクリーニングやがん細胞の動態予測に用いるプラットフォームとして研究を進めていくことを計画している。また上述した実験に追加し、開発した光応答性CRISPR-Casシステムをゲノム編集ツールとして利用することも検討している。現状ではハイドロゲルの力学特性を制御する目的で開発をしているが、効率よく細胞等の遺伝子を編集するための改良を行うことを計画している。 以上のように、バイオマテリアルと分子生物学を融合することで分析対象となる細胞の機能を制御することで、生命現象を解明する新しい分析手法を提案したい。
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