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進化分子工学および金属錯体化学を駆使したヘムタンパク質の触媒機能拡張

研究課題

研究課題/領域番号 22K14783
研究種目

若手研究

配分区分基金
審査区分 小区分37010:生体関連化学
研究機関大阪大学

研究代表者

加藤 俊介  大阪大学, 大学院工学研究科, 助教 (60909125)

研究期間 (年度) 2022-04-01 – 2025-03-31
研究課題ステータス 交付 (2023年度)
配分額 *注記
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2023年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
2022年度: 2,470千円 (直接経費: 1,900千円、間接経費: 570千円)
キーワード人工金属酵素 / 進化分子工学 / 指向性進化法 / C-H結合官能基化 / 金属ポルフィリノイド / ヘムタンパク質 / 生体触媒 / ポルフィリノイド
研究開始時の研究の概要

本研究は、合成金属錯体を補因子とする人工金属酵素の改変へ指向性進化法を適用し、優れた触媒特性を発揮する新規生体触媒を開発することを目的とする。具体的には、非天然ポルフィリノイドを補因子としてヘムタンパク質へと導入した人工金属酵素を構築する。そして、得られた人工金属酵素のタンパク質反応場を指向性進化法により最適化することで、酵素本来の反応性を拡張する。現時点までに、非天然ポルフィリノイドの合成や、タンパク質の発現系の確立は既に完了している。補助事業期間内において今後、指向性進化法による活性中心のタンパク質反応場の最適化を行い、通常の小分子金属錯体では達成困難な高難度な物質変換の実現をめざす。

研究実績の概要

本研究は、進化分子工学的手法を遷移金属錯体へと応用し、優れた触媒特性を発揮する新規高機能触媒を開発することを目的とする。具体的には、非天然の合成ポルフィリノイドを補因子としてヘムタンパク質に再構成した「人工金属酵素」を構築し、指向性進化法(directed evolution)を駆使した遺伝子工学的な改変を実施する。2023年度は、鉄コロール錯体を補因子としてミオグロビンに導入した人工金属酵素を構築し、指向性進化法によるタンパク質反応場の改変を実施した。ミオグロビンのヘム結合サイトを構成する複数のアミノ酸残基を選定し、部位飽和変異導入(site-saturation mutagenesis)によりランダム化した変異体ライブラリをスクリーニングすることで、ABTSの酸化反応に対して高いペルオキシダーゼ活性を示す変異体を獲得することに成功した。この得られた変異体は、
改変前の人工金属酵素と比較して、24倍高い反応初速度を示すことが判明した。加えて、鉄ポルフィリン錯体を補因子としてミオグロビンに導入した人工金属酵素についても、遺伝子工学的改変を実施し、アルドキシムの脱水反応に対する触媒活性を向上させることに成功している。また、効率的な人工金属酵素の指向性進化を実現するために、Strep-tag IIを精製タグに用いた新たなハイスループットスクリーニング(HTS)手法の確立にも成功している(S. Kato et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2023, 62, e20230376.)。本HTS手法は、安価なキチン粉末をクロマトグラフィー担体として用いて、人工金属酵素の指向性進化を細胞夾雑物非存在下で実現する強力な手法である今後、このHTS手法を最大限に活用し、進化分子工学による高機能金属酵素の開発に着手する。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究は、指向性進化法(directed evolution)による人工金属酵素の遺伝子工学的な改変を実施し、優れた触媒活性を発揮する新規高機能触媒を開発することを目的とする。2023年度は、目標の一つであった非天然金属ポルフィリノイド(鉄ポルフィセン錯体)を補因子とする人工金属酵素について、指向性進化法による改変を実施し、ニトリル合成反応における触媒活性を向上させることに成功した。また、コバルトコリン錯体・コバルトポルフィセン錯体を補因子とする他の人工酵素の構築も実施しており、今後、これら人工金属酵素の指向性進化法による改変も行う予定である。加えて、効率的な指向性進化の実現に資する基盤技術の開発にも精力的に研究を実施した。なかでも、Strep-tag IIを精製タグに用いた新規ハイスループットスクリーニング(HTS)手法は、今後の研究展開を加速する基盤技術となることが期待される。以上の成果から、おおむね順調に進展しているとの評価を行った。

今後の研究の推進方策

今後の研究推進方策として、以下の2項目について特に重点を置き研究を遂行する。(i) 指向性進化の結果得られた上記の鉄コロール錯体および鉄ポルフィセン錯体を含む人工金属酵素について、詳細な解析(X線結晶構造解析・速度論解析)を実施する。そして、指向性進化法により導入されたアミノ酸残基への変異が、非天然の金属錯体の触媒活性にどのように寄与しているのかを明らかにする。(ii) 2023年度に新しく構築したコバルトコリン錯体・コバルトポルフィセン錯体を補因子とする人工金属酵素について、指向性進化法による改変を実施し、優れた触媒特性を示す変異体を獲得する。この時、指向性進化法のスクリーニングには、上記のStre-tag IIを精製タグに用いた新規ハイスループットスクリーニング(HTS)手法を活用する。

報告書

(2件)
  • 2023 実施状況報告書
  • 2022 実施状況報告書
  • 研究成果

    (27件)

すべて 2024 2023 2022 その他

すべて 国際共同研究 (2件) 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 1件、 査読あり 3件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (17件) (うち国際学会 6件、 招待講演 5件) 図書 (2件) 備考 (3件)

  • [国際共同研究] RWTH Aachen University/Bielefeld University(ドイツ)

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [国際共同研究] RWTH Aachen University(ドイツ)

    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [雑誌論文] Chitin‐ and Streptavidin‐Mediated Affinity Purification Systems: A Screening Platform for Enzyme Discovery2023

    • 著者名/発表者名
      Kato Shunsuke、Takeuchi Koki、Iwaki Motonao、Miyazaki Kentaro、Honda Kohsuke、Hayashi Takashi
    • 雑誌名

      Angewandte Chemie International Edition

      巻: 62 号: 31

    • DOI

      10.1002/anie.202303764

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Evolutionary Engineering of a Cp*Rh(III) Complex-Linked Artificial Metalloenzyme with a Chimeric β-Barrel Protein Scaffold2023

    • 著者名/発表者名
      Kato Shunsuke、Onoda Akira、Schwaneberg Ulrich、Hayashi Takashi
    • 雑誌名

      Journal of the American Chemical Society

      巻: in press 号: 15 ページ: 8285-8290

    • DOI

      10.1021/jacs.3c00581

    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Engineering of hemoproteins2023

    • 著者名/発表者名
      Hayashi Takashi、Kato Shunsuke
    • 雑誌名

      Comprehensive Inorganic Chemistry III

      巻: 3 ページ: 215-230

    • DOI

      10.1016/b978-0-12-823144-9.00142-4

    • ISBN
      9780128231531
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] キチン粉末を利用したアフィニティー精製手法の開発:シクロプロパン化反応を触媒する微生物酵素の探索への応用2023

    • 著者名/発表者名
      加藤 俊介、竹内 康基、林 高史
    • 学会等名
      第49回生体分子科学討論会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] Evolutionary Engineering of Artificial Metalloenzymes for Abiotic Transformations2023

    • 著者名/発表者名
      Shunsuke Kato
    • 学会等名
      SPEED×Bottom-up Biotech×ELSI joint workshop
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Directed Evolution of a Rh(III)-Linked Artificial Metalloenzyme for C-H Bond Functionalization2023

    • 著者名/発表者名
      Shunsuke Kato
    • 学会等名
      Gordon Research Conference -Expanding the boundaries of Protein Engineering-
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] In vitro High-Throughput Screening Platforms for Protein Engineering and Enzyme Discovery2023

    • 著者名/発表者名
      Shunsuke Kato
    • 学会等名
      Vortrag im Rahmen des Organisch-Chemischen IOCB-Kolloquiums
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] キチン粉末を利用したタンパク質精製手法の開発: 非天然化学反応を指向した酵素探索への応用2023

    • 著者名/発表者名
      加藤 俊介、林 高史
    • 学会等名
      生物無機化学シンポジウム
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 有機触媒反応から学ぶ光駆動型ラジカル酵素の創製2023

    • 著者名/発表者名
      加藤 俊介
    • 学会等名
      学術変革領域(A) 予知生合成科学 第3回公開シンポジウム
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] In vitro High-throughput Screening of Hemoprotein Library for Stereodivergent Synthesis of 1,2-Disubstituted Cyclopropanes2023

    • 著者名/発表者名
      Shunsuke Kato
    • 学会等名
      1st Unified Catalysis Joint Symposium
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] 非天然化学反応を指向した微生物酵素の探索と遺伝子工学的改変2023

    • 著者名/発表者名
      加藤 俊介
    • 学会等名
      日本農芸化学会2004年度大会 大会シンポジウム「物質生産技術の革新を目指した予知生合成科学」
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 多糖高分子を利用したタンパク質精製手法の開発:非天然化学反応を指向した酵素探索への応用2023

    • 著者名/発表者名
      加藤 俊介
    • 学会等名
      日本薬学会第144年会 一般シンポジウム「化学の力で拓く革新的タンパク質研究」
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] キメラ型バレルタンパク質を基盤とするロジウム含有金属酵素の指向性進化:芳香族C-H結合官能基化反応への応用2022

    • 著者名/発表者名
      加藤俊介、小野田晃、Ulrich Schwaneberg、林高史
    • 学会等名
      第48回生体分子科学討論会
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [学会発表] アフィニティ精製手法を活用したハイスループットスクリーニング系の構築と鉄コロール錯体を導入したミオグロビンの指向性進化への応用2022

    • 著者名/発表者名
      竹内康基、加藤俊介、林高史
    • 学会等名
      第34回生物無機化学夏季セミナー
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [学会発表] キチン粉末を利用したアフィニティー精製手法の開発:非天然化学反応を触媒する微生物酵素の探索への応用2022

    • 著者名/発表者名
      加藤俊介、林高史
    • 学会等名
      第16回バイオ関連化学シンポジウム
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [学会発表] Directed Evolution of an Artificial Metalloenzyme Containing an Iron Corrole Complex Using a High-throughput Screening Platform Based on an Affinity Purification System2022

    • 著者名/発表者名
      竹内康基、加藤俊介、林高史
    • 学会等名
      錯体化学会第72回討論会
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [学会発表] Evolutionary Engineering of a Rh(III)-linked Artificial Metalloenzyme for Isoquinoline Synthesis via C(sp2)-H Bond Activation2022

    • 著者名/発表者名
      加藤俊介、小野田晃、Ulrich Schwaneberg、林高史
    • 学会等名
      10th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Directed Evolution of Myoglobin Reconstituted with an Iron Corrole Complex Base on a Screening Platform Based on an Affinity Purification System2022

    • 著者名/発表者名
      竹内康基、加藤俊介、林高史
    • 学会等名
      10th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Directed Evolution of Myoglobin Reconstituted with an Iron Corrole Complex: Development of Artificial Peroxidase with Enhanced Catalytic Activity2022

    • 著者名/発表者名
      竹内康基、加藤俊介、林高史
    • 学会等名
      第103回日本化学会春季年会
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [学会発表] ミオグロビンを利用した人工金属酵素の開発:アルドキシム脱水反応によるニトリル合成2022

    • 著者名/発表者名
      阿部美笛、加藤俊介、林高史
    • 学会等名
      第103回日本化学会春季年会
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [図書] バイオサイエンスとインダストリー2024

    • 著者名/発表者名
      加藤 俊介、林 高史
    • 総ページ数
      272
    • 出版者
      バイオインダストリー協会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [図書] 化学「2023年の化学 注目の論文」酵素で光り輝く有機合成2023

    • 著者名/発表者名
      加藤俊介
    • 総ページ数
      2
    • 出版者
      株式会社 化学同人
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [備考] 指向性進化法を駆使した人工金属酵素の創製

    • URL

      http://www.cfi.eng.osaka-u.ac.jp/seeds/seeds_list_1/kato_shunsuke_assist/

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [備考] 自然界にない化学反応を実現する人工酵素の開発

    • URL

      https://miraibook.jp/researcher/sa23009

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [備考] 指向性進化法を駆使した 人工金属酵素の創製

    • URL

      http://www.cfi.eng.osaka-u.ac.jp/seeds/seeds_list_1/kato_shunsuke_assist/

    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書

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公開日: 2022-04-19   更新日: 2024-12-25  

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