| 研究課題/領域番号 |
22K14863
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分38060:応用分子細胞生物学関連
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
池田 敦子 広島大学, 統合生命科学研究科(生), 助教 (70909093)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2024年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
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| キーワード | 酵母 / Tricalbin / セラミド / 非小胞輸送 / 脂質ホメオスタシス |
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| 研究開始時の研究の概要 |
生体膜を構成するセラミドは、様々な疾患に対して治療のターゲットとして注目されているにもかかわらず、細胞内セラミド量がどのように決定されるかは十分に理解されていない。細胞内セラミド量の調節には“セラミドのオルガネラ間輸送”が重要な役割を果たすが、セラミドの非小胞輸送を実行・制御する詳細なメカニズムの解明は遅れている。申請者は、小胞体の膜タンパク質Tricalbinが非小胞輸送に必要であることを発見している。そこで本研究では、Tricalbinとの物理的相互作用を足掛かりとしたアプローチによって、セラミド非小胞輸送に関与するレギュレーター等のタンパク質を同定し、機能を解明することを目指す。
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| 研究実績の概要 |
細胞内セラミドの量はオルガネラ間輸送によってコントロールされている。小胞体からゴルジ体へのセラミド輸送には、小胞輸送に加えて非小胞輸送が存在する。これまでの解析から私たちは、真核細胞で保存された小胞体膜タンパク質であるTricalbin (Tcb1, 2, 3) が、セラミドの非小胞輸送に必要であることを発見した。しかしながら、Tricalbinの機能がどのように制御されているか、他にはどのようなタンパク質が関与しているのかなど、セラミド非小胞輸送機構の全貌は未だ謎に包まれている。そこで本研究は、セラミド非小胞輸送に関与する候補タンパクのリストアップと機能同定を目指す。この目的を達成するために本年度は、Tcb3タンパク質と相互作用するタンパク質の同定を試みた。研究実績の概要は、以下の3点である。(1)Tcb3ドメインと相互作用する細胞質タンパク質の同定：GFPタグを融合したTcb3の細胞質ドメインを用いて、抗GFP抗体を用いた免疫沈降法によって結合タンパク質を精製し、質量分析によって同定を行った。 (2) Tcb3と相互作用する膜タンパク質の同定：当初は技術的に困難であると予想されたことから、細胞質タンパク質のみを対象として解析する予定であった。しかし、実験手法を洗練したことにより、膜タンパク質の精製および同定に成功した。(3)同定されたタンパク質とTcb3の結合について、免疫沈降法およびウエスタンブロッティングによって検証を行い、候補となるタンパク質をリストアップした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本年度は、研究実施計画に従って、セラミド非小胞輸送に関わるタンパク質候補の探索を実施し、いくつかの候補を取得することが出来た。なかでも特筆すべき点は、当初の計画で提案していた細胞質タンパク質のみならず、膜タンパク質をも候補としてリストアップできたことである。これにより、本研究目的の達成により近づいた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は当初の計画通り、同定した候補の中から非小胞輸送に関与するものを明らかにする目的で、同定したタンパク質の機能解析を行う。ひとつは、候補タンパク質にGFPやmCherryなどの蛍光標識を融合させた発現プラスミドまたは株を作製し、通常時およびセラミド非小胞輸送が促進されると考えられる条件下において、その細胞内局在を蛍光顕微鏡観察により調べる。もうひとつは、タンパク質の立体構造モデルを構築し、立体構造的知見からタンパク質の特徴や機能を探る。
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