| 研究課題/領域番号 |
22K14894
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分39040:植物保護科学関連
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| 研究機関 | 静岡県立大学 |
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研究代表者 |
岡本 拓実 静岡県立大学, 薬学部, 研究支援員 (90885245)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2027-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2026年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2025年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2024年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2023年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2022年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
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| キーワード | ジャガイモシストセンチュウ / ソラノエクレピンA / 異宿主発現 / バイオインフォマティクス |
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| 研究開始時の研究の概要 |
ジャガイモシストセンチュウはトマトやジャガイモ、ナスなどのナス科植物特異的に寄生する、植物寄生性センチュウの一種とされ、一方的に植物体の栄養を奪い続ける農害虫である。そのため、多くの研究者がその防除法の開発を試みてきたが、未だに効果的な方法は開発されていない。そこで、植物から発せられている孵化誘因物質であるソラノエクレピンAの生合成遺伝子、経路を解明を遺伝子操作技術等を用いることで解明し、ソラノエクレピンA高生産株を作出することで、ジャガイモシストセンチュウへの完全な防除法の開発を目指す。
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| 研究実績の概要 |
世界中で甚大な被害をもたらしているジャガイモシストセンチュウ（potato cystnematode: PCN）の孵化誘因物質として知られているsolanoeclepin A（solA）の生合成遺伝子・経路の同定を目指した。これまでに、ナス科植物を用いたゲノムのリシーケンシングや孵化活性に準じたトランスクリプトーム解析を行うことによって、いくつかの遺伝子を候補遺伝子として挙げていた。そこで、それらの遺伝子を対象にRNAiやCRISPR-Cas9システムを用いた遺伝子操作やNicotiana benthamianaを宿主とした遺伝子の一過性発現によるin vivo試験を行うことで、候補遺伝子の機能解析を行った。形質転換については、まずは様々な書籍、文献を参考にして実験条件を設定し、実験を行った。しかしながら、所望の形質転換体を獲得することができなかった。そこで、形質転換体を作出するために使用している抗生物質（ハイグロマイシンB）の濃度をいくつか条件検討を行い、培地に含有しているスクロースの量も検討した。その結果、当研究室において最適な条件を獲得でき、現在は順調に進行している。異宿主発現については、まず候補遺伝子を一過性で発現させるための発現ベクターに導入した。その後、アグロインフィルトレーション法を用いることで、Nicotiana benthamianaに発現させた。それを各種有機溶媒を用いて抽出し、HPLCなどの解析機器にて生産している化合物の確認、また、遺伝子の機能解析を行った。現在は解析が終わっているものもあるが、最終生成物であるsolAが微量生成物であると同時に、中間体と思われる化合物の微量であると考えられるので、解析に時間がかかっている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初予定していた候補遺伝子の異宿主発現を終え、その機能解析を順次行っている。やはり最終生成物であるsolAが微量成分であることから、中間体も同じく微量であると考えられたため、その解析に難航している。RNAiやCRISPR-Cas9システムを用いた形質転換体の作出は、当研究室で行ったことがない実験操作が多かったため、その実験条件を選定するのに時間がかかったが、現在では正しい条件で実験が行えており、形質転換体の作出に向けて順調に進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
形質転換体は順調に作出できているので、それができ次第、水耕栽培液に排出された化合物や植物体体内で生産されている化合物の探索に取り掛かる。それが本研究に適した中間体であると考えられたとき、各種解析機器を用いることで、化合物の構造を決定する。また、形質転換によって欠失させた遺伝子と同様に発現変動する遺伝子を選定することで、候補遺伝子とし、さらなる解析を行っていく。異宿主発現は、現在候補になっている遺伝子についてはサンプリングが行えているので、形質転換によって、実際に孵化活性がなくなった遺伝子を中心に解析を行う。また、本研究課題において、Nicotiana benthamianaが生産する解析に不必要な化合物を生産させない株を作出することによって、今後の解析をスムーズに行えるようにする。
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