| 研究課題/領域番号 |
22K15036
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分43010:分子生物学関連
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
河添 好孝 九州大学, 理学研究院, 助教 (60805422)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2023年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
2022年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
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| キーワード | ミスマッチ修復 / DNA二重鎖切断修復 / Homology-directed repair / 一本鎖アニーリング / ツメガエル卵抽出液 / 試験管内再構成 / 相同組換え |
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| 研究開始時の研究の概要 |
相同組換えは、塩基配列の相同性を利用してDNA二重鎖切断損傷を正確に修復する、遺伝情報の安定維持に必須の修復経路である。しかしながら、細胞内には多くの類似配列が存在し、それら配列間での組換えは細胞のがん化や遺伝病の原因となる。類似配列間での誤った組換えは中間体上にミスマッチ塩基を生じ、これにミスマッチ修復（MMR）機構が応答する。本研究では、MMR機構によって誘導される誤った組換えを抑制する反応（抗組換え反応）とミスマッチ塩基を修正する反応を精製タンパク質を用いて試験管内再構成することで、それら２つの反応を制御するメカニズムと抗組換え反応の分子メカニズムの理解を目指す。
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| 研究実績の概要 |
DNA二重鎖切断（DSB）は最も重篤なDNA損傷の一つであり、その正確な修復には、相同組換えによる修復が重要である。相同組換えは塩基配列の相同性を利用して、DSB修復に利用する配列を探索する。しかしながら、生体内には多くの類似配列が存在し、それら配列間での組換えは染色体転座などを引き起こし、細胞のがん化や遺伝病の原因となる。類似配列間での誤った組換えが生じると、組換え中間体上にミスマッチ塩基を生じ、これにミスマッチ修復（MMR）機構が応答する。MMR機構は、ミスマッチの生じた原因に応じて、誤った組換え反応を抑制する反応（抗組換え反応）とミスマッチ塩基を修正する反応を制御しながら、状況に応じた適切なDSBの修復に寄与していると考えられる。しかしながら、ミスマッチの認識後に、それぞれの反応が制御されるメカニズムはわかっていない。
本研究では、精製タンパク質を用いてMMR機構が制御する二つの反応を試験管内再構成することで、MMR機構によるDSB修復の正確性を制御するメカニズムの理解を目指した。これまでに、反応の再構成に必要であると予測される因子の精製法の確立、改良を行い、精製した全ての因子において生化学的に活性を確認した。次に精製因子を用いて、相同配列間での組換え反応を試験管内で再構成した。組換え因子は、それ自体では配列の選択性が低く、10%程度の配列の類似性は区別できなかった。また、誤った配列間での組換え中間体の解消反応やミスマッチ塩基の修正反応について再構成を試みた。反応全体の効率は悪いものの、部分反応の再構成を完了した。今後は、これまでに完了させたそれぞれの反応を組み合わせることで解析ツールを作り出し、組換え反応の正確性制御メカニズムに迫っていきたい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに、反応の再構成に必要と考えられる全因子の精製方法の確立、改良を行い、因子の活性も生化学的に確認した。精製因子を用いて、組換え反応、誤った組換え反応の中間体の解消反応、ミスマッチ塩基の修正反応、の３反応について、不完全ながらも再構成できたと考えている。さらに、それぞれの再構成系を用いて、反応メカニズムの解析も進んでいる。今後、それぞれの反応効率を改善することが求められるものの、本研究の目的解明の手段となる系の構築に向けて着実に進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
DNAの安定維持のためにはDSB修復に用いる配列探索は非常に正確に、一方で、遺伝的多様性を生み出すためには、ある程度の配列類似性を許容する必要がある。適切な時期に適切な反応を誘導・制御するメカニズムを理解するためにも、反応因子を任意に操作できる試験管内再構成系は解析系として優位性がある。今後はまず、現在3つの反応に分けて再構成を試みている反応系を組み合わせることで、類似配列間での組換えの結果生じたミスマッチを起点として進む反応の解析系を完成させる。その後、反応に関わる様々な要素を変化させることで、何がDSB修復の正確性に影響を与えるか解析し、MMR機構による組換え反応正確性の制御メカニズムを明らかにしていく。
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