| 研究課題/領域番号 |
22K15106
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分44010:細胞生物学関連
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
有本 飛鳥 広島大学, 統合生命科学研究科(理), 助教 (00794603)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2024年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2023年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | RNA輸送 / 核外輸送 / クビレズタ / 緑藻 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
緑色海藻クビレズタ Caulerpa lentillifera（流通名：海ぶどう）は陸上植物のような形状の巨大な単細胞生物であり，その体内には多数の細胞核が存在する。形状が異なる各部位には，それぞれ異なるRNAが局在しているが，RNAの転写が生じる細胞核は一か所にとどまっていない。本研究では各部位の細胞核内で転写中のRNAと細胞質のRNAをそれぞれ単離し，それらを次世代シークエンサーで網羅的に同定してレパートリーを比較することで，クビレズタのRNA局在に対する部位特異的な転写や核外輸送の寄与を明らかにすることを目指す。
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| 研究実績の概要 |
海ぶどうとしても知られる緑色海藻のクビレズタは、陸上植物に類似した複雑な形態を持ち、数メートルに成長することもあるが、物理的な仕切りを体内にもたない単細胞生物である。単一の巨大な単細胞の各部位を様々な形態に変形させる、もしくは各部位の形態を維持するにあたっては、必要とされる遺伝子を適切な部位に局在することが重要と考えられる。しかしながら、クビレズタの細胞内ではRNAの転写が生じる細胞核を含む各種のオルガネラは特定の部位にとどまらず移動しているため、細胞核で転写されたRNAが細胞内の適切な部位で細胞質に輸送されるとの仮説が生じる。
本研究では、クビレズタの形状が異なる各部位から細胞核と細胞質に存在するRNAを単離し、細胞核と細胞質のRNAレパートリーを部位間や部位内で比較することで、部位特異的なRNAの転写や輸送の有無を明らかにすることを目的としている。本研究においては、細胞核および細胞質に含まれるRNAをそれぞれ単離することが、重要な技術的課題となる。特に細胞質に由来するRNAのみを得る工程は、先行研究において多くの手法が確立されている細胞核RNAの単離と異なり、単離手法の確立のみならず、細胞質以外に由来するRNAの混入を評価する手法の確立も必要とされる。
本年度の研究においては、サンプル調製時に細胞核が損傷すると細胞質に核ゲノムDNAが放出されることに着目し、クビレズタの核ゲノムDNAを高感度かつ特異的に検出するためのリアルタイムPCRに用いるプライマーセットを構築できた。このプライマーセットを用いて、研究開始時に有用と考えられていた手法で細胞質から得たRNAに対して核ゲノムDNAの混入を評価したところ、全サンプルにおいて混入が検出されたため、手法の改良を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究初年度においては、細胞核と細胞質に存在するRNAをそれぞれ単離し、次世代シークエンサーで網羅的に同定してレパートリーを同定する予定であった。しかし、研究開始時に計画していた手法では、細胞核と細胞質のRNAを明確に区別して単離することが困難であることが明らかとなった。とくにサンプル調製時に破損した細胞核に由来するRNAが細胞質に混入することが問題となっている。このように、RNA単離手法の改善が必要となったため、現在は手法の改善に取り組んでいる状況にある。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初予定していた細胞核と細胞質に存在するRNAをそれぞれ区別して単離する方法は、想定していた分離能を示さなかった。したがって、オルガネラ自体の単離方法が確立されている細胞核に由来するRNAを単離調製する一方で、細胞質RNAについては細胞核と細胞質を区別せずに調製し、双方のサンプル間でRNAのレパートリーを比較することが、データの解像度が低下する可能性はあるものの、問題を解決する現実的な手法として想定される。
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