| 研究課題/領域番号 |
22K15169
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分45020:進化生物学関連
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| 研究機関 | 基礎生物学研究所 |
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研究代表者 |
依田 真一 基礎生物学研究所, 進化ゲノミクス研究室, 特任助教 (70897751)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)
2024年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
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| キーワード | アブラムシ / 細胞内共生 / 遺伝子導入 / piggyBac / 共生 / トランスジェニック |
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| 研究開始時の研究の概要 |
昆虫であるアブラムシとその細胞内共生細菌ブフネラは、お互い相手なしでは生存できない緊密な共生関係にある。その特異さゆえ100年以上にわたって共生研究のモデル系として着目されてきた。しかしアブラムシでは有効な遺伝子改変技術がなかったため、細胞内共生が確立した背景にどのような至近要因があったのかはほとんど分かっていない。私は最近、piggyBacシステムがアブラムシにおいて有効な遺伝子導入法であることを見出した。本研究では新規に開発したトランスジェニックシステムを用いてアブラムシの細胞内共生を可視化し、アブラムシとブフネラの共生を支える分子基盤を遺伝子機能レベルから明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
今年度はエンドウヒゲナガアブラムシにおいてトランスジェニックシステムを確立するために、DNAベクター(piggyBacトランスポゾン) を用いた遺伝子導入法の構築を行った。まず、初期胚で高活性なプロモーター配列を特定するために、蛍光タンパク質上流にプロモーター候補配列を挿入したdonor plasmidを作製し、初期胚にインジェクションした。リアルタイムPCRによって蛍光タンパク質の発現を定量したところ、2種類のプロモーターが初期胚で高活性を示すことがわかった。遺伝子導入個体を作出するために、helperとして改変型piggyBacであるhyper-active piggyBac transposase (hyPBase) を用いてdonor plasmidと一緒に初期胚にインジェクションした。Helperはプラスミド、またはin vitro転写したmRNAとして供給した。その結果、未だ系統化には至っていないものの、発生途中で死亡したG0世代を解析したところ1.4%の割合でモザイク個体が含まれていることがわかった。さらにアブラムシに最適な蛍光タンパク質について検討したところ、アブラムシ卵は緑色の波長域で自家蛍光を発する一方、赤色の波長域では自家蛍光がほとんど見られないことがわかった。そのため、緑色のGFPよりも赤色のDsRedやmCherryなどの蛍光タンパク質の方が遺伝子導入のマーカー遺伝子として適していることが示唆された。アブラムシ卵の孵化率を上げるために、アブラムシ卵へのインジェクション技術についても改良を行った。具体的には、ガラスキャピラリー先端の研磨法と卵のホルマリン処理による防カビ法を確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
幼虫の致死個体に1.4%の割合でモザイク個体が含まれていたものの、未だに遺伝子導入個体の系統化には至っていないため。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、piggyBacシステムをベースに卵へのインジェクションを行うとともに、遺伝子導入効率を上げるためにhelperとしてpiggyBacタンパク質を導入することも検討する。CRISPR-Cas9法を用いたノックイン法についても検討する。
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