研究課題/領域番号 |
22K15388
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研究種目 |
若手研究
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配分区分 | 基金 |
審査区分 |
小区分49010:病態医化学関連
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研究機関 | 大阪公立大学 |
研究代表者 |
本間 拓二郎 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 講師 (70743566)
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研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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配分額 *注記 |
4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)
2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
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キーワード | ChaC1 / グルタチオン / システイン / フェロトーシス / レドックスバランス |
研究開始時の研究の概要 |
グルタチオン(GSH)は活性酸素種の除去や生体異物の解毒に関与するトリペプチドで、生存や胚発生に必須である。その合成量はシステイン (Cys) の供給量に依存し、細胞内Cysが減少してGSHが枯渇すると過酸化脂質が蓄積し、新規細胞死・フェロトーシスを起こす。Cation transport regulator homolog (ChaC)ファミリーは細胞内におけるGSHの分解酵素で、ジペプチダーゼと協調的に働くことでCysの再利用に関係するものの、生体でのレドックスバランスの維持における役割は十分に明らかではない。本研究ではChaCファミリー遺伝子欠損マウスを樹立し、その病態生化学的検討を行うことで、ChaCファミリーの生理機能の解明を目指す。
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研究実績の概要 |
本研究では、ゲノム編集によりChaCファミリーの遺伝子欠損マウスを作製し、その表現型を解析することで、GSH代謝におけるChaCの生体内機能を明らかにする。また、ChaC欠損マウスの解析に加えて、我々が最近樹立したCNDP2との二重欠損マウスを作出し、GSH代謝との相互作用について調べる。さらにこうしたマウスに対する小胞体ストレス誘導剤やGSH枯渇ストレスの影響についても検討し、ChaCファミリーの欠損が各種病態に与える影響を明らかにする予定である。以上の検討により、ChaCファミリーの本来の生理機能を解明し、GSH再利用系の障害が各種病態に及ぼす影響を明らかにすることを目指している。まず、今年度は、マウス生体内でのChaCファミリーのGSH代謝における役割とChaC1・CNDP2を介したGSH再利用系の障害がレドックスバランスの維持に影響を与えることで生体にどのような結果をもたらすかを明らかにするために、ChaC1欠損マウスをゲノム編集により作出することを目指した。初めに、ChaC1遺伝子のexon 1を標的としたガイドRNAおよびCas9ヌクレアーゼを受精卵に導入し、変異の入った個体を作製した。マウス尾の電気泳動およびシーケンス解析の結果、異なる変異をもつゲノム編集マウスを数種得た。いずれもがヘテロ欠損マウスであり、主要臓器を用いたウェスタンブロット解析の結果、ChaC1タンパク質量に違いが認められなかった。その後、ヘテロ欠損個体同士を掛け合わせることで、ChaC1ホモ欠損マウスを2ライン作出することに成功した。いずれのラインも、ChaC1遺伝子が完全欠損しているのに関わらず、正常に発生して生存可能であることが明らかになった。また、今のところ、通常飼育環境で外見や行動観察上異常を認めず、生殖系に影響を与えていない。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の令和4年度の目標として、ChaC1欠損マウスがゲノム編集を用いて無事に樹立できたから。
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今後の研究の推進方策 |
ChaC1欠損マウスの個体数を増やす。その後、剖検を行い、血液検査 (肝臓ALT・腎臓BUN・心臓CPK)、組織学的解析 (H&E染色) を行う。血中ならびに主要臓器のGSH・Cys・Cys-Glyなどの代謝産物をLC-MSで測定して、GSH代謝系に異常があるかどうか、また、臓器間クロストークへの影響を明らかにする。ChaC1欠損マウスではとくにChaC1が恒常的に発現している膵臓や胃を中心に解析を行う予定である。ノックアウトすることで全身での表現型が認められない場合、ストレプトゾトシン誘発Ⅰ型糖尿病モデルや急性腎障害モデル(虚血再灌流障害)の導入を施し、腎障害時におけるChaC1を介したGSHの保護作用を検討する予定である。
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