結核菌・抗酸菌の遺伝子改変のためのマイコファージ様形質導入粒子の簡易作製法

• 研究課題/領域番号: 22K15456
• 研究種目: 若手研究
• 配分区分: 基金
• 審査区分: 小区分49050:細菌学関連
• 研究機関: 岐阜大学
• 研究代表者: 満仲 翔一 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 研究員 (10836406)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円); 2024年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円); 2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
• キーワード: バクテリオファージ / 合成生物学 / 遺伝子組換え

研究開始時の研究の概要

本研究では、結核菌・抗酸菌に感染するファージ (マイコファージ) を改変することで生じる、ファージゲノムの代わりにプラスミドを頭部に搭載したファージ粒子、「形質導入粒子」を誰でも簡単に作製することができるシステムの構築を目指す。結核菌・抗酸菌の遺伝子改変は困難であるが、形質導入粒子を利用すればプラスミドの導入や相同組換えを利用した遺伝子改変を簡単に行うことができる。

研究実績の概要

昨年度は、抗酸菌ファージXのパッケージングシグナル (以下、PSと記す)の探索を行なった。本来、PSはファージの頭部にファージゲノムをパッケージングするために必要なシグナル配列である。形質導入粒子の作製にPSの同定は必須である。そこで、ファージゲノム由来の配列約1 kbpを挿入したプラスミドを構築した。挿入した配列の中にPSが存在している場合、そのプラスミドを保持する細菌を介してファージを増殖させると、形質導入粒子が産生される。この形質導入粒子が感染すると、ファージゲノムではなくプラスミドが宿主細菌に導入される。実際に、構築したプラスミドを保持する抗酸菌を使ってファージライセートを調製し、そのライセートと抗酸菌を混ぜ、選択培地上に塗布した結果、複数のコロニーを確認した。解析の結果、これらのコロニーは構築したプラスミドを保持していることが判明した。また、抗酸菌と混ぜずにライセートをそのまま選択培地に塗布した場合及びファージゲノム由来の配列を挿入していないプラスミドを保持する抗酸菌から調製したライセートを混ぜた場合ではコロニーは出現しなかった。これらの結果は、形質導入粒子を介したプラスミドの宿主細菌への導入が起きたことを示しており、挿入した約1 kbp内にPSが存在している可能性を強く示唆するものである。ファージは産生されず、形質導入粒子だけを産生させるためには、さらにPSの最小単位を同定していく必要がある。しかし、ファージXは溶菌性ファージのため、このファージを基に研究を進めるのは難しい。そこで、今後はファージXと非常に相同性が高い溶原性ファージYを基に形質導入粒子の簡易作製法の確立を進めていく予定である。
昨年度末に溶原性ファージYを分与していただいた。ファージゲノムの配列を再度確認後、PSの同定などを進めていく予定である。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

ファージXに至る前に用いていた抗酸菌ファージではPSを同定できず、遅れが生じた。抗酸菌ファージXのPSはプラスミドに挿入した約1 kbpの中に存在していることが示唆されたため、今後はそのファージと相同性の高い溶原性ファージYを基に研究を進めていく。

今後の研究の推進方策

溶原性ファージYのPSの同定及び温度感受性ファージを創出する。また、温度感受性ファージを抗酸菌に溶原化させ、温度依存的に子孫ファージの産生及び溶菌を誘発できるか評価する。PSを同定後、溶原菌のPS欠失株を作製する。PS欠失株にPSを含むプラスミドを導入し、温度依存的に形質導入粒子だけが産生されるか検証する。