| 研究課題/領域番号 |
22K15476
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分49060:ウイルス学関連
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| 研究機関 | 和歌山県立医科大学 |
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研究代表者 |
坂 直樹 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (80867474)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
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| キーワード | ヒトパラインフルエンザウイルス2型 / V蛋白 / 14-3-3ε / アポトーシス / ミトコンドリア |
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| 研究開始時の研究の概要 |
細胞はウイルスが侵入してきた際に、「生きる」為、「死ぬ」為に免疫システムもしくはアポトーシスを誘導し、ウイルスの排除をしていると考えられている。ウイルスはこれら宿主の応答に対して「生かさず殺さず」に自身の複製を計っていると考えられる。14-3-3ε蛋白は免疫システムやアポトーシスにまで広く関与する重要な蛋白である。これまでにヒトパラインフルエンザウイルス2型(hPIV2)のV蛋白は様々な免疫システムを構成する蛋白と結合し、機能を阻害していることが示されてきた。本研究では、hPIV2のV蛋白と14-3-3εとの関係を明らかにし、宿主の免疫応答にどのような影響を与えているのかを検討する。
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| 研究実績の概要 |
ヒトパラインフルエンザウイルス2型(hPIV2)のV蛋白は、これまでに多くの宿主蛋白との結合が報告されており、中でも免疫システムに関与している宿主蛋白と結合することで免疫応答を抑制していることがわかっている。本研究は14-3-3εに着目し、hPIV2のV蛋白と14-3-3εとの結合が宿主の免疫システムやアポトーシスに関与していると考え、研究を進めた。hPIV2のV蛋白と14-3-3εの部分欠損変異体との共免疫沈降(IP)によって、14-3-3εのV蛋白との結合部位はN末端部分であると同定した。さらに、14-3-3εはV蛋白の機能欠損変異体(Vmut)とは結合しないことが分かった。また、14-3-3εのノックダウン細胞株を作製し、それによる解析により、14-3-3εの欠損はhPIV2の増殖を負に制御することが分かった。リバースジェネティクス法により作製したhPIV2の野生型ウイルス(rPIV2/wt)とVmutを持つウイルス(rPIV2/Vmut)を感染させてcaspaseの活性を測定すると、rPIV2/wtはrPIV2/Vmutよりcaspaseの活性化を抑制し、アポトーシスを抑制していることが分かった。14-3-3εは切断されると、アポトーシスが促進されることが知られている。rPIV2/wtの感染により14-3-3εは切断されたが、rPIV2/Vmutを感染させた方が14-3-3εの切断量は増加していた。この結果より、V蛋白あるいはVmutを発現させた細胞にアポトーシス誘導剤を作用させたところ、V蛋白を発現させた細胞は14-3-3εの切断量が減少していたことから、V蛋白は14-3-3εと結合することによって14-3-3εの切断を抑制しており、結果としてアポトーシスを抑制していると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
V蛋白やVmutの発現プラスミド、およびrPIV2/wtやrPIV2/Vmutなどのリコンビナントウイルスは、すでに作製済みであり、本研究に応用することができた。またIPやウエスタンブロッティング(WB)、免疫染色(IFA)でV蛋白を検出するために必要なモノクローナル抗体は所属研究室が保有していたので、研究を滞りなく遂行することができた。これらの豊富な研究試料を使用でき、研究を遂行するために必要な技術を習得した実績のある研究者から適切なアドバイスを得ることができたので、必要な14-3-3εやその部分欠損変異体の発現プラスミド、14-3-3εのノックダウン細胞株を作製することができた。さらに、申請者が作製したプラスミド等を使用し、hPIV2のV蛋白が14-3-3εと結合すること、その結合により14-3-3εの切断が抑制されることを明らかにすることができた。
また、IFAにより14-3-3εと結合する蛋白であるBadの細胞内局在にV蛋白が影響を及ぼしていることが示唆されている。このことから、14-3-3εとBadの結合にV蛋白が関与しているかについての研究を次年度進める予定であり、実験計画書に沿った研究を進めることができているため、おおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
V蛋白と結合が示唆されたBadはミトコンドリア系のアポトーシスに関与する蛋白の一つである。ミトコンドリア系のアポトーシスは、アポトーシスを促進する蛋白であるBad、抑制する蛋白であるBcl-XL、誘導するBaxなどで構成されている。これらを中心にミトコンドリア系のアポトーシスに関連する蛋白に研究対象を広げ、本研究期間で習得した技術を用いて研究課題を推進していく。Bad、Bcl-XL、Baxなどのミトコンドリア系アポトーシスに関連する蛋白の発現プラスミドを作製し、V蛋白とのIPを行い、結合を検討する。結合した蛋白は、部分欠損変異体などの発現プラスミドを作製し、V蛋白との結合部位を同定する。また、rPIV2/wtやrPIV2/Vmutを感染させIFAを行い、Bad以外の関連蛋白の細胞内局在が感染によって変化するのかどうかも検討する。ミトコンドリア系のアポトーシスが誘導されると、ミトコンドリアから細胞質にシトクロムC(Cyt C)が放出される。hPIV2の感染によってCyt Cの量が変化するのかを、細胞質とミトコンドリア画分に分離し、WBによって定量する。さらに、V蛋白およびVmut過剰発現細胞にアポトーシス誘導剤を作用させて、細胞質内のCyt Cの量の変化もWBによって定量する。
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