RNAスプライシング異常に焦点を当てたミトコンドリア病遺伝子解析

• 研究課題/領域番号: 22K15950
• 研究種目: 若手研究
• 配分区分: 基金
• 審査区分: 小区分52050:胎児医学および小児成育学関連
• 研究機関: 順天堂大学
• 研究代表者: 八塚 由紀子 順天堂大学, 大学院医学研究科, 助教 (20458524)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円); 2023年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円); 2022年度: 2,730千円 (直接経費: 2,100千円、間接経費: 630千円)
• キーワード: ミトコンドリア病 / スプライシング異常 / ディープイントロニックバリアント / エクソンスキップ / 疑似エクソン / ゲノム解析 / RNAスプライシング / エキソンスキップ

研究開始時の研究の概要

我々の研究グループが長年にわたるミトコンドリア病研究の中で蓄積してきた臨床情報・次世代シーケンサー（NGS）関連データセット・患者由来細胞・両親兄弟検体を最大限に活用し、遺伝子診断が困難なイントロン領域のバリアント評価に挑む。先行研究で取得したNGS関連データセットには膨大な数のスプラインシング関連バリアントが含まれ、全てについて検証実験を行うことは現実的に不可能であるため、具体的に検証可能な数まで絞り込む方法が必須である。
本研究で構築するバリアント評価システムはゲノム配列のみからバリアントの病原性を評価する手法であり、臨床的意義不明バリアントの解決策の1つになり得る。

研究実績の概要

ゲノム解析技術が飛躍的に進歩してもなお、エクソンから3塩基以上離れた位置に存在するイントロン領域のバリアントに対してゲノムDNAの配列解析からその影響を予測することは困難であるが、これを解決するために新規フィルタリングを導入し、先行研究で取得した1500超のNGSデータセットを活用した再解析を行った。
具体的には、診断確定済症例も含めた全データセットからバリアントを抽出し（約27,000件）、Ferraro(Science 2020)らの見出した配列保存性をもとに絞り込みを行った。既知の病的バリアントが抽出できていることを確認すると同時に、新たな候補バリアントを取得した（約200件）。これらの臨床的意義不明バリアント（VUS, Variant of Uncertain Significance）の中から個々の症例の遺伝形式や臨床症状に鑑み、優先順位をつけて検証実験を進めている。
初年度には合計7症例（6遺伝子）に新規のスプライシング異常を明らかにし、今年度はこれら7症例の検証実験を進めるとともに、さらに8症例（７遺伝子）すなわち通算15症例（13遺伝子）にあらたなスプライシング異常を同定することができた。また、今年度から開始した全血RNAシーケンスは、皮膚線維芽細胞未樹立の症例においてもRNA解析を行うための手段として非常に有意義であることが認められ、その活用範囲は染色体レベルの大きな欠失の同定からスプライシングエラーの同定まで非常に広範囲であった。
本研究において構築中のデータ解析手法により、スプライシング異常が原因となって発症する未診断ミトコンドリア病症例の遺伝子診断が効率的に進んでいる。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

昨年度より行ってきた既存NGSデータを用いた新規フィルタリング法の評価に追加して、今年度は初回64症例の全血RNAシーケンスのデータ取得が完了した。これにより患者由来細胞が未樹立でRNAにアクセスできなかった症例の解析が一気に進んだ。全血RNAシーケンスが非常に有効であることが証明できたので、今後も解析症例数を追加していく。

今後の研究の推進方策

スプライシング異常を検出するのに最も有効で直接的な手段はRNAシーケンスである。①全血RNAあるいは皮膚線維芽細胞を用いたスプライシング異常の検出、②全ゲノムシーケンスによるディープイントロン領域のゲノムDNA配列取得、これら2つの解析を組み合わせることで従来は遺伝子診断を付することが困難であった難解症例（＝ディープイントロン領域に病的バリアントを持つ症例）を解決していくことが可能である。
しかし、死亡症例の場合は前述①の解析において患者由来RNAが使用できないため、ゲノムDNAの配列情報のみでスプライシング異常を検証することが必要である。そこで、この問題を解決できるアッセイシステム（＝ミニジーンアッセイ）の構築に着手した。モデルケースとして特定のインサート配列をアッセイベクターに組み込み、その配列がスプライシングに影響するか否かを確認することが出来たため、アッセイシステムの構築は完了したと言える。今後は遺伝子未診断の各症例において、前述①②の解析でディープイントロン領域の候補バリアントを取得して、随時、本アッセイシステムで検証していく。
最近、12kbのイントロン内のたった1塩基の置換でシュードエクソン（疑似エクソン）を産生する症例が見付かった。これはアンチセンスオリゴを用いた核酸医薬の絶好の標的であり、将来的な治療まで見据えた検証実験を行っていく計画である。

研究成果

• [雑誌論文] Novel ITPA variants identified by whole genome sequencing and RNA sequencing (2023)
  • 著者名/発表者名: Omichi Nanako、Kishita Yoshihito、Nakama Mina、Sasai Hideo、Terazawa Atsushi、Kobayashi Emiko、Fushimi Takuya、Sugiyama Yohei、Ichimoto Keiko、Nitta Kazuhiro R.、Yatsuka Yukiko、Ohtake Akira、Murayama Kei、Okazaki Yasushi
  • 雑誌名: Journal of Human Genetics 巻: 68 号: 9 ページ: 649-652
  • DOI: 10.1038/s10038-023-01156-y
  • 査読あり
• [雑誌論文] Strategic validation of variants of uncertain significance in ECHS1 genetic testing (2023)
  • 著者名/発表者名: Yoshihito Kishita, Ayumu Sugiura, Takanori Onuki, Tomohiro Ebihara, Tetsuro Matsuhashi, Masaru Shimura, Takuya Fushimi, Noriko Ichino, Yoshie Nagatakidani, Hitomi Nishihata, Kazuhiro R Nitta, Yukiko Yatsuka, Atsuko Imai-Okazaki, Yibo Wu, Hitoshi Osaka, Akira Ohtake, Kei Murayama, Yasushi Okazaki
  • 雑誌名: Journal of Medical Genetics 巻: Online ahead of print 号: 10 ページ: 1006-1015
  • DOI: 10.1136/jmg-2022-109027
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Efforts aimed at early genetic diagnosis of suspected mitochondrial diseases: Application of whole blood RNA sequencing (2023)
  • 著者名/発表者名: Yukiko Yatsuka
  • 学会等名: Human Genetics Asia 2023
  • 国際学会
• [学会発表] 【ミトコンドリア病遺伝子パネル】累計556症例の解析 および 保険診療体制の整備 (2023)
  • 著者名/発表者名: 八塚由紀子
  • 学会等名: 第22回日本ミトコンドリア学会年会
• [学会発表] ミトコンドリア病遺伝学検査 (2023)
  • 著者名/発表者名: 八塚由紀子
  • 学会等名: 第7回ミトコンドリア病研究公開フォーラム
• [学会発表] RNAシーケンスから明らかになった7番染色体部分欠失を伴うSengers症候群の一症例 (2022)
  • 著者名/発表者名: 八塚由紀子
  • 学会等名: 日本人類遺伝学会第67回大会
• [学会発表] ミトコンドリア病を対象とした遺伝子パネルシーケンス (2022)
  • 著者名/発表者名: 八塚由紀子
  • 学会等名: 第29回 日本遺伝子診療学会大会
• [図書] 生体の科学 74巻5号 ミトコンドリア病の病態解明と治療法の開発 (2023)
  • 著者名/発表者名: 八塚由紀子、岡﨑康司
  • 総ページ数: 2
  • 出版者: 金原一郎記念医学医療振興財団
• [図書] ミトコンドリア 疾患治療の新時代 第2章 I-1 ミトコンドリア病の遺伝子診断と病態解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 杉山洋平, 八塚由紀子, 村山圭, 岡﨑康司
  • 総ページ数: 7
  • 出版者: 羊土社
  • ISBN: 9784758104098
• [図書] 特集 症例から学ぶミトコンドリア病 [総論] ミトコンドリアDNA変異と遺伝子診断の実際 (2022)
  • 著者名/発表者名: 八塚由紀子, 岡﨑康司
  • 総ページ数: 4
  • 出版者: 東京医学社