骨芽細胞分化と骨形成における線維性異形成症型GNAS変異遺伝子の機能解析

• 研究課題/領域番号: 22K17023
• 研究種目: 若手研究
• 配分区分: 基金
• 審査区分: 小区分57020:病態系口腔科学関連
• 研究機関: 東京歯科大学
• 研究代表者: 明石 良彦 東京歯科大学, 歯学部, 助教 (70875690)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円); 2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
• キーワード: 線維性異形成症 / GNAS遺伝子 / ミスセンス変異 / GNAS変異遺伝子

研究開始時の研究の概要

線維性異形成症(Fibrous Dysplasia: FD)は、骨芽細胞系細胞のGNAS遺伝子のミスセンス変異に起因することが知られているが、病変が発症する骨芽細胞系細胞の分化段階及び未熟な骨組織を伴う線維性結合組織の増生メカニズムは未だ明らかにされていない。
本研究では、FD型GNAS変異遺伝子を導入した種々の分化段階の培養骨芽細胞株を用い、in vitroで細胞増殖／骨芽細胞分化を、in vivoで骨形成能を解析する。
本申請研究の推進により線維性異形成症の発生メカニズムの新たな知見を得ることが期待できる。

研究実績の概要

本研究の目的は、FDの原因であるGNAS遺伝子のミスセンス変異（R201H)が線維性結合組織の増生と骨芽細胞分化／骨形成を制御するメカニズムをin vitro実験系とin vivo移植実験系を用いて明らかにすることである。そのために、まず骨軟骨前駆細胞への分化能を保持する未分化間葉系細胞株であるC2H10T1/2細胞、骨髄間質細胞由来株であるST2細胞、骨芽細胞葉細胞株であるMC3T3-E1細胞を用いて、FD型変異型GNAS遺伝子の役割をin vitro実験系で明らかにする。
R201H変異あるいはR201C変異を導入したヒトGNAS遺伝子cDNAをIRES-GFP配列を含むレンチウイルスベクタープラスミドにクローニングし、パッケージングプラスミドとともに293T細胞にトランスフェクションさせ、培養上清を超遠心濃縮して得たレンチウイルス粒子を用いて、C2H10T1/2細胞、ST2細胞およびMC3T3-E1細胞の各細胞で、FD変異型GNAS遺伝子発現細胞群のR201H群およびR201C群を、コントロールとしてFD変異型GNAS遺伝子非導入群のempty群およびwild　type群を樹立させた。
樹立された各細胞の各郡において、FD変異型GNAS遺伝子の導入をオールインワン蛍光顕微鏡を用いたGFP蛍光により検討したが、導入率が一定ではなかった。このため、GFPを指標としたフローサイトメトリーを行い、GFPを高発現した細胞のみを回収し、今後の実験では、これらの細胞を使用することとした。
in vitro実験系において、GFP高発現のFD変異型GNAS遺伝子導入群および非導入群のC2H10T1/2細胞、ST2細胞およびMC3T3-E1細胞を得られ、現在、各細胞の細胞増殖能の変
化や培養系における骨芽細胞分化の解析を開始し、その検討に着手している。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

本研究では、FDの原因であるGNAS遺伝子のミスセンス変異が線維性結合組織の増生と骨芽細胞分化／骨形成を制御するメカニズム解析のために、in vitro実験系において、FD変異型GNAS遺伝子であるR201H変異およびR201C変異を導入し、GFP高発現を示すC2H10T1/2細胞、ST2細胞およびMC3T3-E1細胞を樹立することができた。
しかしながら、得られた細胞の細胞増殖能の変化や培養系における骨芽細胞分化の解析がまだまだ進んでおらず、やや遅れていると判断している。

今後の研究の推進方策

樹立されたFD変異型GNAS遺伝子発現細胞を用いて、Cell Counting Kitを用いた細胞増殖能の変化、定量的RT-PCRによる骨芽細胞分化関連遺伝子発現などの骨芽細胞分化について検索を進めていく。
さらに、in vivo移植実験系を行い、ヌードマウス頭頂骨骨膜下にFD変異型GNAS遺伝子発現細胞および非導入細胞を移植し、その動態について検討を進めいていく。