レポーター発現RSウイルスを用いたハイスループット中和抗体試験法の開発

• 研究課題/領域番号: 22K17348
• 研究種目: 若手研究
• 配分区分: 基金
• 審査区分: 小区分58020:衛生学および公衆衛生学分野関連:実験系を含む
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 山形 優太朗 長崎大学, 熱帯医学研究所, 特任研究員 (70879410)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円); 2024年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
• キーワード: RSウイルス / 中和抗体試験 / ウイルス合成 / 疫学 / 呼吸器感染症

研究開始時の研究の概要

RSVは乳幼児に感染し急性呼吸器疾患を引き起こすウイルスで、世界で年間6万人以上の5歳未満小児の死因となっているが、安全な治療薬やワクチンはまだ開発されていない。これらの開発やRSV感染症の疫学調査において、臨床検体の中和抗体価の測定は重要だが、測定に多くの時間と労力を要する問題点がある。そこで、レポーター発現組換え体RSVとレポーター活性の自動測定を用いて、従来よりも短時間で効率的なRSV中和抗体試験法を確立し、疫学調査検体を用いて定量性を検証する。さらに、新規組換え体RSVの設計と作出を行い、異なる血清型や遺伝子型に対応した中和抗体試験の実験系の構築を目指す。

研究実績の概要

培養細胞を用いたRSウイルスの感染実験および力価測定実験の系を確立した。レポーターとしてルシフェラーゼを発現する組換え体RSウイルス(rHRSV)と、市販のRSウイルス中和抗体ウサギ血清を用いて、レポーター活性の測定による中和抗体試験の条件検討を進めた。また、「ニャチャン住民コホートを用いた小児呼吸器感染症研究」のプロジェクトで採取されたRSウイルス陽性患者の鼻腔検体から抽出されたウイルスRNA(vRNA)検体を用いて、感染したRSウイルスのジェノタイピングを行った。RSウイルスのA型およびB型のG遺伝子にそれぞれ特異的なプライマーDNAおよびvRNAを用いてRT-PCR反応を行い、vRNAの相補鎖DNAを増幅して電気泳動で検出した。相補鎖DNAを精製してシーケンシングにより配列を解析し、そのデータをもとに遺伝子系統樹解析を行った。結果、A型は25検体、B型は32検体で検出され、B型は32検体すべてがBA9株に近い配列を、A型は25検体中23検体がON1株に近い配列を示した。現在使用しているrHRSVはA型由来であり、抗原性の違いによりB型の検体の中和抗体活性を正確に測定できない可能性がある。この問題点を克服するため、RSウイルスのA型とB型のどちらにも利用可能な感染細胞ELISA法による中和抗体試験法を、先行研究をもとに条件検討して確立した。また、B型の検体の中和抗体試験に利用可能なrHRSVを開発するため、B型由来のウイルス膜蛋白質遺伝子を有するrHRSVのリバースジェネティクス法による合成を目指した。そのための準備として、培養したRSウイルスより抽出したvRNAからRT-PCR法により相補鎖DNAを増幅し、大腸菌を用いてプラスミドベクターにクローニングする作業を進めた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当研究室におけるRSウイルスの感染培養実験系、レポーター発現組換えRSウイルスの感染実験系および感染細胞ELISA法による中和抗体試験法を確立し、RSウイルス陽性患者の血清検体の中和抗体価を測定する準備は整った。ただし、これらの実験条件の検討に用いられた中和抗体は、市販のRSウイルス中和抗体ウサギ血清である。実際の血清検体の中和抗体試験を行うにあたっては、ヒト由来のポジティブコントロールであるRSウイルス陽性患者の血清検体を用いて、検討した実験条件が適切であることを確認する必要がある。このポジティブコントロール血清検体と、「ニャチャン住民コホートを用いた小児呼吸器感染症研究」のプロジェクトにおいて申請者が解析を担当する血清検体は、いずれも当研究室のベトナム拠点に保管されている。これらの血清検体を日本へと輸送するためのベトナム側での手続きが本報告書作成時点で滞っており、血清検体の輸送が完了するまで一カ月から数カ月程度かかる見通しで、それに伴い2年目以降の研究計画に遅れが生じる可能性が予測されている。また、2年目以降の研究計画である「新規合成rHRSVを用いた新たなRSV中和抗体試験法の構築」の前準備として、RSウイルスゲノムのプラスミドへのクローニング作業に着手した。しかし一部の配列を除き培養過程でインサート配列の脱離が生じる等の問題によりクローニングが難航しており、クローニング手法の抜本的な見直しが必要となる可能性が予測されている。以上の結果から、本研究の研究計画調書に記載した1年目の研究計画はほぼ達成されたといえるものの、2年目以降の研究に遅れが生じうる懸念材料がいくつか生じたため、現在までの進捗状況を「おおむね順調に進展している」と判断した。

今後の研究の推進方策

ベトナムの血清検体の日本への輸送が完了するまでの間は、中和抗体試験で必要となる細胞やウイルスのストック作製、およびRSウイルスゲノムのプラスミドへのクローニングと、それを用いた新規rHRSVの合成系の確立の作業を主に進める。RSウイルスゲノムのクローニングに関しては、大腸菌セレクション用の抗生物質や、培養温度、培養時間、使用する大腸菌株およびプラスミドベクターといった、クローニングの根本部分を含めた見直しを行い、改善を図る。RSウイルスゲノムのクローニングが成功した後は、それをもとに新規rHRSV合成用のプラスミドベクターを構築し、BHK/T7-9細胞等のT7ポリメラーゼ発現細胞へのプラスミドベクターのトランスフェクションにより、ウイルスゲノムとウイルス蛋白質を細胞内で発現させて新規rHRSVの合成を行う。このとき、ウイルス膜蛋白質遺伝子をB型由来のものに変更した変異体rHRSVを設計し、B型の検体に応用可能なrHRSVの合成を目指す。B型の検体に応用可能なrHRSVの合成は、当研究室での合成系の確立だけでなく、他の研究室との共同研究による開発も視野に入れている。ベトナムの血清検体の日本への輸送が完了した後は、ポジティブコントロール検体を用いた中和抗体試験の実験条件の確認を行った後、臨床検体の中和抗体試験による解析を進める。検体数は500程度を予定しており、2年目の間に解析が完了する見込みである。中和抗体試験は感染細胞ELISA法による解析を主に行う予定である。ただし、解析対象の検体数が非常に膨大であるため、解析効率の向上のためにレポーター発現rHRSVによる解析を併用することも検討しており、検体の解析開始前の実験条件確認を念入りに行った上で判断する予定である。