DNA損傷応答時に相同組換え修復が担うゲノム安定化機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号	22K18036
研究種目	若手研究
配分区分	基金
審査区分	小区分63030:化学物質影響関連
研究機関	大阪大学
研究代表者	藤田侑里香大阪大学, 蛋白質研究所, 特別研究員(RPD) (50893913)
研究期間 (年度)	2022-04-01 – 2025-03-31
研究課題ステータス	交付 (2023年度)
配分額 *注記	4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円) 2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円) 2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円) 2022年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
キーワード	相同組換え / DNA損傷 / 染色体 / がん
研究開始時の研究の概要	生物は日常的にDNA損傷物質に晒され、その防御機構として多くのDNA損傷修復経路を備えている。相同組換え（Homologous Recombination, HR）修復はその正確さから主要経路の一つとされ、RAD51はDNA損傷領域に結合し中心的な役割を果たす。RAD51の蓄積領域はHRが破綻した際にゲノム再編成が誘導されやすいと考えられるが、その領域の特徴は明らかになっていない。本研究ではRAD51の各種相互作用因子の変異体を解析し、HRが破綻した際に生じる染色体異常部位の特徴を明らかにすることで、DNA損傷応答時に相同組換え修復が担うゲノム安定化機構の解明を目指す。
研究実績の概要	本年度は昨年度に引き続き、相同組換え（HR）関連因子、特にHRを正と負に制御する因子の両者について、それぞれの機能を詳細に解析した。特にDNA損傷の蓄積・修復レベルや、細胞周期の中でもHRが主要な修復経路として機能するDNA複製期への影響について、昨年度樹立した変異体細胞の表現型解析を行った。その結果、各種変異体でDNA損傷の蓄積やHR以外の修復経路の活性化、さらにはDNA複製期（S期）における複製フォークへの顕著な影響が確認された。また追加でS期以外の細胞周期、特にG1期とM期に着目して表現型解析を行い、HR因子欠損に伴う細胞周期への影響も併せて確認した。また昨年度に引き続き、HR関連因子が機能する染色体上の特異性・局在特徴をゲノムワイドに検証するため、RAD51のChIP-seqを実施した。昨年度事前検討時に構築した実験条件（細胞量やリード数）をさらに最適化しつつ、再現性の確認実験を追加で実施した。加えて、特に二本鎖DNAに結合しうるRAD51についてその意義について考察するために二本鎖DNAのみを回収する実験系の構築に着手、条件検討のrunを行った。現在解析を行っている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由新たな変異体細胞の構築がやや遅れている。その他の実験については、変異体細胞の表現型解析をメインで進め、概ね予定通り、順調に進んだ。特に、RAD51の二本鎖への局在解析については、細胞数や必要なDNA量など、当初予定していたより条件検討がスムーズに進んだ。
今後の研究の推進方策	各種変異体で確認された表現型についてメカニズム解明に注力する。特に、DNA複製への影響を詳細に解析し、それぞれの因子の複製期における機能を、他のHR因子の関与を含め解明したいと考える。また、RAD51のゲノムワイドな局在パターン解析については、ゲノム不安定化との関連に加え、ヒストン修飾や転写因子、さらには複製因子との比較解析を通じてその意義と働きを明らかにすることを考えている。