研究課題/領域番号 |
22K18198
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研究種目 |
若手研究
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配分区分 | 基金 |
審査区分 |
小区分90120:生体材料学関連
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研究機関 | 東京農業大学 |
研究代表者 |
宮下 慎一郎 東京農業大学, 生物産業学部, 助教 (20883292)
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研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
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キーワード | ボツリヌス神経毒素 / 凝集タンパク質 / ドラッグデリバリー / DDS / VHH抗体 / 細菌毒素 / 運動神経変性疾患 |
研究開始時の研究の概要 |
神経細胞におけるα-synucleinやアミロイドタンパク質の凝集は神経変性を引き起こす。これら病原タンパク質に対する抗体が開発されているが、標的とする神経細胞内に抗体を送達することは困難である。本研究では、無毒化ボツリヌス神経毒素を基にした抗体送達システムを用いて、神経変性疾患に関与する病原タンパク質の凝集を抑制あるいは分解することを目的とする。
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研究実績の概要 |
近年、研究代表者はボツリヌス神経毒素 (BoNT) を基にしたキメラ毒素 (ciBoNT) を用いることにより、アルパカ由来 VHH 抗体を神経細胞内に送達することに成功した。本研究の目的は、神経細胞において恒常的に産生される内因性病原タンパク質を標的とした分解促進技術の開発である。 本年度は、抗体送達の効率化を目的として、新たに2つのciBoNTキャリアーの開発を行った。BoNTおよびciBoNTキャリアーは3つのドメインから構成される。N末端側から酵素活性ドメイン (LC)、トランスロケーションドメイン (HN)、そして受容体結合ドメイン (HC) である。プロトタイプciBoNTはX型LC-HNおよびA型HCから構成される。 まず、神経細胞への結合に必須であるHCの候補を探索した。ボツリヌス菌培養上清から精製したCD型BoNTとA型BoNTをマウスへ投与すると、ほぼ同程度の投与量で筋肉麻痺を示した。この結果から、CD型BoNTのHC (HC/CD) は効果的に神経細胞に結合することが考えられた。大腸菌を用いて、HC/CDを含むciBoNTの発現を試みたが、分解産物として確認された。 次に、新たなLC-HNドメインの候補探索を行った。2019年、PMP1がハマダラ蚊を標的とするBoNT-like毒素であることが報告された。PMP1のLCに点変異導入し酵素活性を不活化し、大腸菌組換え発現系によりciBoNT/PmA (LCHN/PMP1-HC/A) を発現し精製した。マウスにciBoNT/PmAを腹腔内投与すると神経麻痺症状を呈した。このことから、PMP1ドメインはciBoNTキャリアーに不適であることが考えられた。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度は、新たに2つのキメラ毒素ciBoNTの作製を試みた。大腸菌組換え発現系において様々な発現条件を検討したが、CD型HCを含む安定なciBoNTは発現しなかった。BoNT-like毒素であるPMP1のLCHNドメインは酵素活性を不活化したにも関わらずマウスに毒性を示した。以上の結果から、抗体送達キャリアーとしてのciBoNTの評価が順調に進展していると考える。
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今後の研究の推進方策 |
病原タンパク質であるα-synuclein、TDP-43 あるいは SOD-1などを標的とする。この病原タンパク質に対する抗体やペプチドをキメラ毒素ciBoNTに連結し、組換えタンパク質として発現、精製する。病原タンパク質を蓄積した培養神経細胞モデルを構築し、抗体送達効率および標的タンパク質の分解について検証する。 さらに、X型BoNTの不活化LCがなぜマウスに毒性を示さないかを明らかにするために、X型LCと相互作用する細胞内タンパク質について検証していく。
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