| 研究課題/領域番号 |
22K19129
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| 研究種目 |
挑戦的研究(萌芽)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
中区分38:農芸化学およびその関連分野
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
和地 正明 東京工業大学, 生命理工学院, 教授 (90192822)
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| 研究期間 (年度) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
6,240千円 (直接経費: 4,800千円、間接経費: 1,440千円)
2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
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| キーワード | ジペプチド / アミノ酸 / 代謝制御 / カタボライト抑制 / GcvB sRNA / グルタミン / アラニルグルタミン / GcvB small RNA / 大腸菌 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究ではGcvB small RNAを介したジペプチドによるアミノ酸代謝抑制機構の全容を解明することを目指す。ジペプチドの分解に関与するペプチダーゼの多重欠損株Δpeps株を用いて、アミノ酸の代謝（生合成や取り込み、排出など）遺伝子についてジペプチドの添加の有無により発現量の変化を解析する。さらにジペプチドやトリペプチド、テトラペプチド等のオリゴペプチドについてアミノ酸代謝抑制活性を検定し、本制御系のシグナル分子の実体を解明する。得られた知見をもとに、細胞内ジペプチド濃度が上昇してもアミノ酸生合成が抑制されない株を構築し、ジペプチドの発酵生産株の育種に応用する。
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| 研究実績の概要 |
大腸菌のグルタミン要求性変異株(ΔglnA株)をM9グルコース最少培地にて培養し、ジペプチドであるアラニルグルタミンと単体のグルタミンを添加した時の細胞の増殖と、添加したジペプチド及びアミノ酸の消費速度を測定した。グルタミン源として10 mMアラニルグルタミンと10 mMグルタミンをそれぞれ単独で加えたときは、アラニルグルタミンを添加した時の方がグルタミンを添加した時よりも短いラグ時間で増殖を開始し、その後の増殖速度も速かった。この時、アラニルグルタミンはグルタミンより早く消費された。興味深いことに、10 mMグルタミンに少量(0.5 mM)のアラニルグルタミンを添加すると、10 mMアラニルグルタミン添加時と同じように増殖した。このことから、それぞれ単独で加えた場合にはアラニルグルタミンはグルタミンより早く消費されること、また少量のアラニルグルタミンはグルタミンの消費を促進することが示唆された。まずこの現象にGcvB sRNAが関与しているかを調べた。その結果、gcvB欠損株でも同様の現象がみられたことからGcvB sRNAは関与していないことが明らかになった。そこで、この条件でジペプチドにより発現の変化する遺伝子の解析を行った。グルタミン代謝に関わる遺伝子の発現を定量RT-PCRにより測定したところ、グルタミンに少量のアラニルウルタミンを添加するとグルタミンの取り込み担体をコードするglnHPQ遺伝子の発現がグルタミン単独添加時と比べて数倍に上昇していることが判明した。このことから少量のアラニルグルタミンはグルタミンの取り込みを促進していることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画ではペプチダーゼ多重欠損株Δpeps株を用いてジペプチドの有無により発現量が変化する遺伝子をRNA-Seq解析により同定する予定であったが、2022年度の実験結果を踏まえて、大腸菌グルタミン要求性変異株(ΔglnA株)にジペプチドであるアラニルグルタミンと単体のグルタミンを添加した時の増殖とアミノ酸代謝に対する影響を調べるための新しい実験系の構築を行った。特にグルタミン代謝に関わる遺伝子について定量RT-PCRにより発現量の変化を調べた。変更した計画にそってほぼ予定通りに実験を進めることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
グルタミン要求性変異株(ΔglnA株)にグルタミンと少量のアラニルグルタミンを添加した時に、グルタミン取り込み単体の発現が顕著に増大するメカニズムの解明を目指す。特に窒素代謝関連転写因子等の遺伝子に注目して定量RT-PCR解析により発現量の変化を調べる。まずは窒素飢餓を感知する２成分制御系をコードするntrBC遺伝子や窒素応答シグマ因子をコードするrpoN遺伝子の関与について調べる。
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