| 研究課題/領域番号 |
22K19143
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| 研究種目 |
挑戦的研究(萌芽)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
中区分38:農芸化学およびその関連分野
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
山下 哲 金沢大学, 物質化学系, 准教授 (70361186)
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| 研究期間 (年度) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
6,240千円 (直接経費: 4,800千円、間接経費: 1,440千円)
2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2022年度: 3,250千円 (直接経費: 2,500千円、間接経費: 750千円)
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| キーワード | 天然ゴム / イソプレノイド / NMR / 無細胞翻訳系 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
天然ゴムは非常に高分子量のポリイソプレンであり，ゴムノキの樹液で作られ，ゴム粒子と呼ばれる膜に囲まれたナノ粒子となり，乳化している（この状態をラテックスと呼ぶ）。ゴム粒子は，その大きさによって，粒子表面に存在するゴム合成酵素の活性に強弱があることがわかってきた。また，ゴム粒子を全体的にコーティングする役割の膜タンパク質の量とも相関が見られている。これまでの研究から，この膜タンパク質によって膜が乱され，ゴム合成酵素の活性が高まることが予想された。また，ゴム粒子内部の状態も重要と考え，これらを検証することで，天然ゴムができる仕組みを理解することを目的としている。
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| 研究実績の概要 |
本研究は，天然ゴム生合成の未解決問題である「ゴム合成酵素の活性発現機構」と「ゴム分子量制御」を，ゴム貯蔵器官であるゴム粒子に存在する膜タンパク 質・脂質およびゴム粒子内部のダイナミクスをキーとして解明することを目的としている。天然ゴムは植物が蓄積する疎水性高分子であり，平均分子量が100万 に達するポリイソプレンである。天然ゴムはパラゴムノキの樹液として採取され，ゴム粒子(RP)と呼ばれる脂質小胞に格納されている。また，ゴム合成酵素はRP の膜表面にあり，モノマーを与えると，新規な重合反応により生じたゴムが膜を横切ってRP内部へ追加される。ラテックスには様々なサイズのRPが存在するが， 平均粒径が小さいゴム粒子は高分子量ゴムを含み，表面酵素によるゴム重合活性が高い。それに対し，平均粒径がより大きいゴム粒子は，低分子量ゴムを含んで おり，表面酵素の重合活性が低い。このことから，ゴム合成酵素の活性は，膜に存在する因子や，膜の特性に依存して，変動している可能性が高い。RPの膜には 多くの膜結合性タンパク質が存在するが，Rubber Elongation Factor(REF)が最も多量に含まれる。REFをRPやリポソームへ再構成すると，膜粒子が分裂する現象が観察されているため，生体膜の変形と出芽を誘発する因子であると考えられる。 今年度の実績として，精製した組換え型REFの15N標識体を調製することに成功し、長期間のNMR測定に耐え得る安定性の高いものであることを確認した。その後、13C-15N二重標識体の調製も検討し、測定対象となる画分の収量が最大となる最適化を行った。今後，ゴム合成酵素等との共存によるシグナルの変化を測定し、REFとその他の因子の相互作用解析を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
パラゴムノキのゴム粒子に多量に存在する膜タンパク質であるREFの組み換え体を大腸菌内でインクルージョンボディとして発現させ，界面活性剤を用いたリ フォールディングにより，可溶化することができ，高純度に精製する手法を15N標識体、および13C-15N二重標識体の調製へ応用し、特にコストの高い後者については、測定に必要な画分が最大となるような最適化を遂行できた。現在，1H-15N HSQCなどのNMR測定を順次進めており，今後は，パートナータンパク質であるSRPPやHRBPなどの共存下におけるREFの状態変化を確認する。また、13C-15N二重標識体のスペクトルの主鎖帰属を試みており、１３０残基あまりの全長配列から、アミドプロトンの無いプロリン残基（９残基存在）を除き、その半数以上の帰属を試みている。以上により，ゴム粒子膜のダイナミクスに関連すると思われるREFの構造解析と，相互作用するタンパク質との溶液中ダイナミクスの観察 が進んでいる。また，組換え型REF、ゴム粒子、脂質一重膜粒子等を用いて、膜の状態の変化が誘導されるかどうかに関して、中性子回折の実験を行うための準備を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究においては，組換え型REFのドデシルマルトシド界面活性剤とのミセルの状態をNMRで測定することを継続する。他の界面活性剤については、すでにコール酸ナトリウムや、オクチルグルコシド、Triton-X100などは試行しており、その溶液中ミセル状態の安定性はドデシルマルトシドが最も高いものの、コール酸ナトリウムなどにおいて、REFの二次構造変化を示唆するような円二色性分光法のデータが得られており、REFの多量体構造もやや大きくなることが予想されているため、興味深い。以上と関連して，ダイズ由来リン脂質であるホスファチジルコリンを主とした脂質を用いて、リポソームを調製し、REFとの混合アッセイおよび混合体の精製を行っており、界面活性剤とリン脂質の急速な交換反応が溶液中で起こることが示唆されている。そこで、我々が最近開発した脂質一重膜粒子を使用した場合、どのような変化が起こるかを観察する予定である。安定同位体ラベルしたREFについては，ドデシルマルトシドミセルに深く埋もれている領域があると予想されているため、それ以外の溶液と近い領域の主鎖帰属を完了させる予定である。また、現在精製している全長REFのN末端領域に、数残基程度ではあるが、精製中の切断を受けやすい領域が存在するため、あらかじめ対応する部分を除いたコンストラクトを作成したい。この改良型REFのほうが、主鎖帰属および、パートナータンパク質や脂質との相互作用解析に適しているかどうかを見極めていく予定である。
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