研究課題
挑戦的研究(萌芽)
CRISPR-Cas3を用いたゲノム編集技術が社会実装に貢献するためには、生体における有用性を示すことが不可欠である。一方、CRISPR-Cas3の変異導入メカニズムは未解明であり、生体内の多種多様な細胞種によってどの程度効果を示すかどうかを実験的に検証する必要がある。本課題では、光制御システムを用いて、低侵襲、高効率、高精度にCRISPR-Cas3活性を制御できる時空間制御CRISPR-Cas3プラットフォームの構築を目指す。
真核細胞における新規ゲノム編集ツールとして我々が開発したCRISPR-Cas3システムは、数百～数kbの広範な欠失変異を導入するというこれまでにない特徴を有しており、独自性、発展性に富んだ国産ゲノム編集技術として期待されている。しかし、精密にCRISPR-Cas3を制御するシステムがなく、生体内でのゲノム編集機能も未知である。そこで本研究では、低侵襲、高効率、高精度にCRISPR-Cas3を時空間的制御するシステム基盤および動物モデルの構築を目指した。本年度は、これまでに構築した第三世代Tet-onシステムを用いた薬剤誘導性CRISPR-Cas3システムを生体内で実施するため、本コンストラクトをRosa領域に導入したノックインラットの作製および樹立を行った。また実際にドキシサイクリンを摂餌投与してCRISPR-Cas3システムの発現解析を行った。加えて、更なる精密な時空間制御を行うため、分担者が開発してきた光スイッチシステムと、分割化したCRISPR-Cas3を組み合わせたPA-Cas3システムのスクリーニング実験を行った。結晶構造情報を用いたin silico解析により同定した、スプリット候補領域約30か所について、それぞれコンストラクトを作製してCRISPR-Cas3として機能するかどうかを検証した。
3: やや遅れている
本研究では、低侵襲、高効率、高精度にCRISPR-Cas3を時空間的制御するシステム基盤および動物モデルの構築を目指している。細胞での評価および最適化が完了した薬剤制御性CRISPR-Cas3プラットフォームについて、セーフハーバー領域であるRosa26領域を対象にKIラットの作出を行った。申請者が開発した高効率ノックイン法Combi-CRISPR法を用いて導入を試みた結果、作成および系統化に成功した。そこで実際にドキシサイクリンを摂餌投与してCRISPR-Cas3システムの発現解析を行った結果、発現の変動がみられなかった。そのため現在、発現変動がみられるドキシサイクリン投与条件を複数検討中である。また光依存的制御システムの構築については、青色光照射によりタンパク質を結合できる光スイッチシステムと、分割化したCRISPR-Cas3を組み合わせて、光依存的に活性を示す可能性のあるスプリット位置を約30か所同定し、すべてのポジションについてのCRISPR-Cas3コンストラクトを作成し、ヒト細胞におけるスクリーニングを実施した。しかし、すべてのコンストラクトで光依存的な活性変化を得ることができなかった。そのため、標的部位をCas3から異なるCas因子にするなどの検討を現在行っている。
次年度も継続して、生体内でのゲノム編集光および薬剤制御性法の開発を目指す。薬剤制御性CRISPR-Cas3システムについては、樹立したtet-Cas3Cascadeノックインラットのホモ系統に対して、ドキシサイクリンの投与方法を飲水投与または腹腔内投与に変更して実施しし、全身臓器におけるRNAおよびタンパク発現解析を行い、発現強度およびリークの有無の確認を実施する。その後、発現がみられる臓器について、AAVまたはLNPを用いてgRNAを投与し、各部位におけるゲノム編集効率の評価およびオフターゲット解析を発現解析、NGS解析、組織化学的解析により行うことで、生体内での最適な活性化条件を決定する。光制御性CRISPR-Cas3システムは、引き続き新しいスプリット位置の検証およびコンストラクトを作成し、ヒト細胞におけるスクリーニングを実施する。良い結果が得られたコンストラクトは、マウスまたはラットにCombi-CRISPR法を用いてRosa領域にKIし、系統化する。以上により、低侵襲、高効率、高精度にCRISPR-Cas3を時空間的制御するシステム基盤および動物モデルの構築を目指す。
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すべて 雑誌論文 (16件) (うち査読あり 7件、 オープンアクセス 7件) 学会発表 (11件) (うち国際学会 4件、 招待講演 8件) 産業財産権 (2件)
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