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がん治療法で解く葉緑体DNA修復機構

研究課題

研究課題/領域番号 22K19329
研究種目

挑戦的研究(萌芽)

配分区分基金
審査区分 中区分44:細胞レベルから個体レベルの生物学およびその関連分野
研究機関京都大学

研究代表者

西村 芳樹  京都大学, 理学研究科, 助教 (70444099)

研究期間 (年度) 2022-06-30 – 2025-03-31
研究課題ステータス 交付 (2023年度)
配分額 *注記
6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)
2024年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
2023年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
2022年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
キーワード葉緑体DNA / UVA / DSB / DNA修復 / DNA修復機構 / 葉緑体 / cpDNA
研究開始時の研究の概要

「葉緑体DNA」は光合成や葉緑体の生合成に必須の遺伝子群の発現を担う光合成の要である。しかし葉緑体DNAの修復機構についての理解は未だ不十分である。本研究では、UVA照射とブロモデオキシウリジンを組み合わせることで、生きた細胞で葉緑体DNAのみを断片化する手法の開発に挑み、この技術を基盤として葉緑体DNA修復機構の全貌に迫ることを目指す。

研究実績の概要

葉緑体DNAは、光合成電子複合体の近傍に位置するため、常に活性酸素種などの遺伝毒性物質に曝露される。そのため迅速なDNA修復が不可欠なはずであるが、その分子機構の詳細は十分に理解されていない。本研究では、細胞核、葉緑体、ミトコンドリアにそれぞれ存在するDNAのうち、葉緑体DNAだけに二本鎖切断(Double strand break: DSB)を引き起こす手法の開発に取り組み、葉緑体DNA修復機構の時空間的理解を目指している。
本研究で用いたのは、1980年代に動物細胞で用いられたUVA照射によるDSB誘導法である。BrdU標識したDNAをHoechst染色すると、通常は無害であるはずのUVA(365 nm)照射によって二本鎖切断が引き起こされる。本研究では単細胞緑藻クラミドモナスをモデルとして、FuUrd存在下で葉緑体DNAのみをBrdU標識することで、UVA照射によって生きた細胞の葉緑体DNAのみにDSBを導入する方法の開発に取り組んだ(BrdU/UVA/hoechst-mediated pt/cpDNA scission: BUMPS法)。DSB検出法として用いたのは、アポトーシスにおけるDSB検出法としてしられるTUNEL法である。この手法により様々な処理条件でのDSBを解析したところ、UVC(254 nm)照射では蛍光顕微鏡下で細胞核と葉緑体核様体の両方にDSBが観察されたのに対し、BrdU/FrUrd/Hoechst処理細胞では葉緑体核様体のみDSBが検出された。さらにUVA照射5分後の葉緑体核様体では明瞭に観察されたDSBが、30分後には検出されなくなったことから、葉緑体DNA修復に要する時間が明らかになってきた。現在、RNAseqによる細胞応答について、さらに解析を進めている。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

これまで葉緑体DNA修復機構は、葉緑体ゲノムに対し薬剤処理や遺伝子変異がもたらす長期的影響を解析することで進められてきたが、本研究によってはじめて、「時間軸」のある研究が可能となった。また、葉緑体DNAに対してTUNEL法を応用することで、高感度で葉緑体DNAのDSB傷害を検出できるようになった。この手法をさらに発展させれば、これまで過小評価されてきた植物の葉緑体DNA傷害、たとえば野外環境で生育する植物の葉緑体DNA傷害についてより広範な検証が可能となるだろう。

今後の研究の推進方策

1. BUMPS法による葉緑体DSB誘導条件の最適化:UVCやZeocinによる非特異的DSB誘導に対するBUMPS法による葉緑体DNA特異的DSB誘導について、さらに実験条件の最適化をおこなう。
2. 葉緑体におけるDSB修復の時空間的理解:BUMPS法により導入されたDSBがどれくらいの時間で修復されるかについて、定量的解析を進める。
3. 葉緑体/ミトコンドリア/細胞核ゲノム修復の網羅的解析:BUMPS処理後、DNA修復がおこなわれた細胞について、処理前後のゲノムをDNAseq解析によりゲノムワイドに比較し、どのゲノムにどれだけどのような修復エラーが蓄積したかを検証することで、修復機構の詳細に迫る。
4. プラスチドシグナルと細胞核遺伝子応答:BUMPS処理後の細胞についてRNAseqをおこなうことで、プラスチドシグナルにより誘導される細胞核遺伝子応答について解析をおこなうことで、葉緑体DNA修復機構の全体像に迫る。さらにプラスチドシグナルに関わると報告される変異体群についてBUMPS処理をおこなうことで、どの経路が葉緑体DNA修復に関わるかを絞り込んでいく。

報告書

(2件)
  • 2023 実施状況報告書
  • 2022 実施状況報告書
  • 研究成果

    (19件)

すべて 2023 2022 その他

すべて 雑誌論文 (1件) (うち国際共著 1件、 査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (16件) (うち国際学会 3件、 招待講演 5件) 図書 (1件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] A conserved RWP-RK transcription factor VSR1 controls gametic differentiation in volvocine algae2023

    • 著者名/発表者名
      Geng Sa、Hamaji Takashi、Ferris Patrick J.、Gao Minglu、Nishimura Yoshiki、Umen James
    • 雑誌名

      Proceedings of the National Academy of Sciences

      巻: 120 号: 29

    • DOI

      10.1073/pnas.2305099120

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [学会発表] 葉緑体DNAとの同時観察から、炭酸固定装置ピレノイドの構築機構に迫る2023

    • 著者名/発表者名
      金澤晴樹、田草川真理、川島愛音、鹿内利治、西村芳樹
    • 学会等名
      第13回日本光合成学会年会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] SMC様タンパク質の機能から迫る、ピレノイド構築における葉緑体核様体の役割2023

    • 著者名/発表者名
      金澤晴樹、川島愛音、田草川真理、鹿内利治、西村芳樹
    • 学会等名
      第17回クラミドモナス研究会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] クラミドモナスの炭酸固定加速装置ピレノイドの構造形成における葉緑体DNAの役割の解析2023

    • 著者名/発表者名
      金澤晴樹、川島愛音、田草川真理、鹿内利治、西村芳樹
    • 学会等名
      第65回日本植物生理学会年会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] BUMPS 法によって解く葉緑体 DSB 修復機構2023

    • 著者名/発表者名
      川島愛音、西村芳樹
    • 学会等名
      第17回クラミドモナス研究会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] BUMPS 法で導入した葉緑体DSB は速やかに除去される2023

    • 著者名/発表者名
      川島愛音,金澤晴樹,鹿内利治,西村芳樹
    • 学会等名
      第65回日本植物生理学会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] Transmission of chloroplast nucleoids is regulated by DNA supercoils during cell division.2023

    • 著者名/発表者名
      Nishimura, Y., Takusagawa, M., Yokota, H., Kobayashi, Y., Hamaji, T., Shikanai, T.,,,2023,2023,1,1
    • 学会等名
      The 20th international conference on the Cell and Molecular Biology of Chlamydomonas
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] 葉緑体 DNA 修復機構の時空間的理解に向けて2023

    • 著者名/発表者名
      川島愛音、鹿内利治、西村芳樹
    • 学会等名
      第16回クラミドモナス研究会
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [学会発表] An Establishment of Novel Technique for cpDNA Specific DSBs Induction2023

    • 著者名/発表者名
      川島愛音、鹿内利治、西村芳樹
    • 学会等名
      第64回日本植物生理学会年会
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [学会発表] Topology-dependent dynamics of chloroplast DNA in Chlamydomonas during cell division2023

    • 著者名/発表者名
      Yokota, H. and Nishimura, Y.
    • 学会等名
      International Conference on Biological Physics 2023
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 葉緑体DNA結合タンパク質MFP1はチラコイド膜上でどのような因子と相互作用するのか2023

    • 著者名/発表者名
      野戸康生、西村芳樹、藤井翔
    • 学会等名
      第64回日本植物生理学会年会
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [学会発表] 葉緑体核様体はピレノイドと相互作用するか2023

    • 著者名/発表者名
      金澤晴樹、川島愛音、田草川真理、鹿内利治、西村芳樹
    • 学会等名
      第16回クラミドモナス研究会
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [学会発表] Exploring the Role of Chloroplast Nucleoids in the Maintenance of Pyrenoid, a Phase-separated Structure2023

    • 著者名/発表者名
      Kanazawa,H., Takusagawa,M., Kawashima, A., Shikanai, T. and Nishimura, Y.
    • 学会等名
      第64回日本植物生理学会年会
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [学会発表] 葉緑体 DNA の修復機構を探る2022

    • 著者名/発表者名
      川島愛音、西村芳樹
    • 学会等名
      第15回クラミドモナス研究会
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [学会発表] Deciphering the dynamism of chloroplast nucleoids.2022

    • 著者名/発表者名
      Nishimura, Y.
    • 学会等名
      Gordon Research Conference Mitochondria and Chloroplast
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Enzymes controlling the inheritance of chloroplast DNA.2022

    • 著者名/発表者名
      Nishimura, Y.
    • 学会等名
      Metalloenzymes - cofactor assembly, catalytic mechanism and redox partners
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Exploring the role of chloroplast nucleoids in the maintenance of the pyrenoid, a phase-separated structure in chloroplasts2022

    • 著者名/発表者名
      Kanazawa,H., Takusagawa,M., Kawashima, A., Shikanai, T. and Nishimura, Y.
    • 学会等名
      International Symposium on Photosynthesis and Chloroplast Regulation
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
    • 招待講演
  • [図書] the chlamydomonas sourcebook third ed.2023

    • 著者名/発表者名
      Joo, S., Kobayashi, Y., Lee, J-H., Nishimura, Y.
    • 総ページ数
      32
    • 出版者
      Elsevier
    • ISBN
      9780128224571
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [備考] 葉緑体核様体のダイナミズムを探る

    • URL

      https://sites.google.com/view/shikanailab/research/nishimura-group

    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書

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公開日: 2022-07-05   更新日: 2024-12-25  

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