研究課題/領域番号 |
22K19460
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研究種目 |
挑戦的研究(萌芽)
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配分区分 | 基金 |
審査区分 |
中区分50:腫瘍学およびその関連分野
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研究機関 | 近畿大学 |
研究代表者 |
今野 大治郎 近畿大学, 理工学部, 准教授 (00362715)
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研究期間 (年度) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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配分額 *注記 |
6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)
2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)
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キーワード | 微小液滴 / ドロップレット / モノクローナル抗体 / 機能性抗体 |
研究開始時の研究の概要 |
本研究の目的である高機能性抗体(高親和性・高選択性・機能抑制/亢進))を高確率に得るために重要なポイントは主に以下に示した3 つの点である。そこで本研究では、各項目の後に示した具体的な目標を達成する形で研究を進め、最終的にそれらを統合することにより、機能性抗体産生リンパ球のハイスループット単離法を確立する。 ① 免疫動物における高機能性抗体産生の惹起-->RNA 免疫法による高機能性抗体産生の惹起 ② 目的に合った手法によるスクリーニング-->微小液滴を用いた機能性抗体産生リンパ球の同定 ③ ハイスループット化-->セルソーティングと1 細胞遺伝子発現解析によるハイスループット化
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研究実績の概要 |
本年度は研究実施計画で策定した3 つのAim の中のAim1およびAim2を達成するため以下の準備を進めた。Aim3については後述の通り予備実験を進め、問題点の確認とその解決方法を考案した。 (Aim1) RNA免疫法による高機能性抗体産生の惹起を目指し、合成mRNAをデザインした。既報の論文を参考にHSD17B4の5'UTR-ターゲット遺伝子-PSMB3の3'UTRの後にhistone stem-loop poly(A)100を接続した構築を考案した。また、抗体作製ターゲット分子として、腫瘍内浸潤Treg細胞での特異的な発現が報告されているヒトCCR8を選定した。これらのRNAをin vitroで合成する際、RNA免疫においてその有効性が報告されているウラシルを1メチルシュードウリジンに置換し、また5'末端にキャップ構造を付加したものを合成した。これらの合成RNAがDNA免疫と比較して高効率な免疫反応の惹起が可能かを現在検討中である。 (Aim2) 微小液滴(ドロップレット)を用いた高機能性抗体産生リンパ球の同定を目指し、マイクロ流体デバイス(On-Chip droplet generator)による細胞含有water-in-oil型微小液滴の作製を試みた。細胞にはテストケースとしてA431細胞およびEGFR細胞外ドメイン認識抗体産生ラットハイブリドーマ(株式会社細胞工学研究所より供与)を用いた。その結果、A431およびハイブリドーマを共に含む約100um経ドロップレットを作製することに成功した。その際、細胞培養培地中に蛍光標識二次抗体を加えることにより、抗体が反応したA431細胞を蛍光により可視することに成功した。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究実施計画で策定した3 つのAim の中のAim1およびAim2に関して予定通り計画を実施できた。Aim2に関しては実際に実験を実施することで問題点が複数確認されたが、これらについてはドロップレット作製装置のバージョンアップによる解決を試みており、計画は順調に進展していると判断できる。またAim3については予定より先行して予備実験を実施しているが、使用したゲル化剤が想定通りに固まらないなど複数の問題が確認されている。しかし後述する通りこれらの問題点の多くは解決策を見出せており、次年度も順調に進むことが期待できる。
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今後の研究の推進方策 |
今後は研究実施計画で策定した3 つのAim の中のAim1およびAim2に加え、Aim3についても実施を進める。具体的にはセルソーティングと1細胞遺伝子発現解析によるハイスループット化を目指し、微小液滴をゲル化させる方法を検討する。本年度はそのための予備実験を実施したが、当初予定していた融解低融点アガロースおよび光硬化ゲル化剤は送液中にゲルが固化するなど取扱が非常に難しく、実際の使用が困難であることが判明した。そこで、チオール基を付加した4分岐ポリエチレングリコール(4-arm-PEG-SH)と西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)を組み合わせたゲル化法を用いた結果、ドロップレット作製後のゲル化に成功したことから、今後はこの新しいゲル作製方法を軸としてAim3の実現を目指す。
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