| 研究課題/領域番号 |
22K19464
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| 研究種目 |
挑戦的研究(萌芽)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
中区分50:腫瘍学およびその関連分野
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| 研究機関 | 関西医科大学 |
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研究代表者 |
坂本 毅治 関西医科大学, 医学部, 教授 (70511418)
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| 研究期間 (年度) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)
2023年度: 2,600千円 (直接経費: 2,000千円、間接経費: 600千円)
2022年度: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
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| キーワード | 転移 / ケミカルラベリング |
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| 研究開始時の研究の概要 |
がん転移はがん細胞と間質の細胞の相互作用により成立する。がん細胞－間質細胞の物理的な相互作用はがん細胞の血管内・外遊走に特に重要なステップであるが、間質中の細胞のごく一部の細胞が一過性にがん細胞と接着するため、生体でがん細胞と物理的相互作用をした間質細胞にどのような変化が起こっているかを包括的に解析する手法の開発が切望される。そこで、本研究ではケミカルラベリングの手法をin vivoの細胞標識に応用し、実験的肺転移モデルでのがん細胞の血管外遊走を解析の対象とし、血管内皮細胞の標識を目標とした、がん血管外遊走時の細胞間相互作用を標識するin vivo ケミカルラベリング法の開発を行う
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| 研究実績の概要 |
error-prone PCR法によりHRP/mgSrtAにミュータジェネシスを行い、多様な変異を導入した酵素配列を取得した。これらの変異導入酵素をpDisplayベクターを用いて細胞膜上に発現させ、かつT2A配列下にtdTomatoを挿入したレンチウイルス発現ベクターを作製し、Jurkat細胞に遺伝子導入しライブラリー細胞を作製した。このライブラリー細胞に対して、HRP、mgSrtAそれぞれ既報の酵素反応条件を参考にして、ライブラリー細胞の細胞膜上で酵素活性依存的な近傍タンパクのFITCラベルを実施した。標識後の細胞をフローサイトメトリーに供し、tdTomatoの発現量で補正した際のHRP/mgSrtAラベリング活性を解析した。まず、Jurkat親株と野生型の酵素を発現する細胞でのFITCラベルを比較した結果、野生型配列で十分なラベル化が検出できることを確認した。続いて、野生型とライブラリー細胞との比較を行った。その結果、loss of functionの表現型を示す変異は多く認められたが、野生型配列に比べてラベリング効率が上昇したHRP/mgSrtA発現細胞を得ることが出来なかった。以上の結果から、今回用いたライブラリー細胞では、野生型の酵素活性を上回るラベル化効率を示す変異型酵素の同定にはいたらなった。そのため、今後は変異導入を増やしたライブラリー細胞の作製とスクリーニングを実施するライブラリー細胞のスケールアップにより、問題点の解決を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
スクリーニングまでは順調に進んだが、スクリーニングの結果、野生型の酵素活性を上回る活性をもつHRP/mgSrtAが取得できなかった。原因として、mutagenesisの効率の低さやライブラリー規模が小さすぎた可能性が考えられるため、この点について改善を試みる必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究実施期間を1年間延長し、mutagenesisの頻度を上げたライブラリーを作製しなおし、あ新たな改変HRP/mgSrtA発現ライブラリー細胞を作製する。そののち、FCMを用いたスクリーニングを行い野生型に比べてラベリング活性が上昇した細胞を取得し、変異型HRP/mgSrtAのシーケンス情報を取得する。活性が上昇した変異型HRP/mgSrtAをがん細胞に発現させ、in vitroおよびin vivoでの近傍細胞のラベル化を確認し、血行性転移における血管内皮細胞ラベリングの新たな手法として有用かどうかを評価する。
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