| 研究課題/領域番号 |
22K19488
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| 研究種目 |
挑戦的研究(萌芽)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
中区分52:内科学一般およびその関連分野
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
才津 浩智 浜松医科大学, 医学部, 教授 (40402838)
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| 研究期間 (年度) |
2022-06-30 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
6,370千円 (直接経費: 4,900千円、間接経費: 1,470千円)
2023年度: 2,470千円 (直接経費: 1,900千円、間接経費: 570千円)
2022年度: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
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| キーワード | ハイスループットスクリーニング / 次世代シークエンス / ミスセンス変異体 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
網羅的変異タンパク質安定性解析という新たな研究スキームの確立を目指して、下記の研究項目を推進する。
(1)GFP融合ランダム変異体のハイスループット表現型スクリーニング: 変異体の細胞発現とフローサイトメーターによる蛍光強度を指標としたタンパク質安定性評価と細胞分取
(2)次世代シークエンスによる変異体の配列決定: ショートリードとロングリードシークエンスの利点を生かした、多数の変異体のコーディング領域全長の配列決定
(3)無～低発現変異体の発現実験での確認と既知バリアントデータとの相関の検証: 実験系の感度と特異度を、細胞での発現実験と既知バリアントデータから検証
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| 研究実績の概要 |
令和4年度の解析で、当初計画していた方法では個々のクローンだけが挿入された細胞を分取するのが困難であることがわかり、変異導入後に大腸菌のシングルコロニーを単離して個々のクローンDNAを精製し、細胞にトランスフェクションを行い、蛍光強度を確認後にクローンのロングリードシークエンスを行った。
1. 変異体発現ベクターライブラリの蛍光確認: 104個のランダム変異体クローンをトランスフェクションして蛍光強度を確認したところ、GFP融合ランダム変異体の蛍光強度によって2群に分けられた（Type 1 GFP発現、Type 2 GFP減弱,）。Type 1（11クローン）およびType 2（13クローン）についてロングリードシークエンスを行った。
2. 変異体解析結果と考察: Type 2は平均変異数が4で、Type 1の平均変異数2に比べて変異が多い傾向が見られた。Type 1の3クローンは変異がヘテロ接合性にコールされているものもあり、2クローンの混合である可能性が示唆された。Type 2ではナンセンス変異やフレームシフト変異も3クローンで認められ、蛍光評価と一致する知見が得られた。患者で同定されたバリアントのデータベースであるClinVarや集団のアレル頻度のデータベースであるgnomADのデータを統合的に解析することで、各クローンでの病的ミスセンス変異が同定されたクローンが4クローンあり、合計で7クローンにおいて病的変異が同定された。興味深いことに終止コドンの変異が1クローンあり、STXBP1の終止コドンの変異も病的である可能性が示唆された。Type 1には、PolyPhen2やAlphamissense, REVELスコアいった病的予測スコアが高値の7変異が含まれており、in silicoの病的予測スコアはあくまで参考で、機能評価が重要であることが改めて確認された。
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