ミスセンス変異体の安定性に注目したハイスループット機能評価系の開発

• 研究課題/領域番号: 22K19488
• 研究種目: 挑戦的研究(萌芽)
• 配分区分: 基金
• 審査区分: 中区分52:内科学一般およびその関連分野
• 研究機関: 浜松医科大学
• 研究代表者: 才津 浩智 浜松医科大学, 医学部, 教授 (40402838)
• 研究期間 (年度): 2022-06-30 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2023年度)
• 配分額: 6,370千円 (直接経費: 4,900千円、間接経費: 1,470千円); 2023年度: 2,470千円 (直接経費: 1,900千円、間接経費: 570千円); 2022年度: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
• キーワード: ハイスループットスクリーニング / 次世代シークエンス / ミスセンス変異体

研究開始時の研究の概要

網羅的変異タンパク質安定性解析という新たな研究スキームの確立を目指して、下記の研究項目を推進する。

(1)GFP融合ランダム変異体のハイスループット表現型スクリーニング: 変異体の細胞発現とフローサイトメーターによる蛍光強度を指標としたタンパク質安定性評価と細胞分取
(2)次世代シークエンスによる変異体の配列決定: ショートリードとロングリードシークエンスの利点を生かした、多数の変異体のコーディング領域全長の配列決定
(3)無～低発現変異体の発現実験での確認と既知バリアントデータとの相関の検証: 実験系の感度と特異度を、細胞での発現実験と既知バリアントデータから検証

研究成果の概要

本研究では、タンパク質の安定性に影響を与えるミスセンスバリアントの評価を、GFP融合タンパク質の発現によってハイスループットスクリーニングする解析系を確立した。GFP融合ランダム変異体を104クローン作成し、うち24個の蛍光評価とシークエンスをおこなったところ、病的予測スコアが高値の7バリアントを有するクローンでも蛍光強度が保たれていた。in silicoの病的予測スコアはあくまで参考で、機能評価が重要であることが確認された。

研究成果の学術的意義や社会的意義

遺伝子解析において、1アミノ酸の置換に過ぎないミスセンスバリアントは病的意義不明のバリアントと分類されることが多く、その機能評価が重要な課題となっている。本研究で確立した蛍光強度に基づいたタンパク質安定性のハイスループットスクリーニングは、遺伝子産物でも適用可能であり、かつ特別な機器を必要としない。この挑戦的研究によりProof of Conceptとなる研究成果を得ることで、希少疾患の原因遺伝子においてミスセンス変異タンパク質の安定性データベースが多くの研究者によって構築され、分子構造の理解とバリアントの解釈に大いに貢献することが期待できる。