研究課題
挑戦的研究(萌芽)
癌による骨喪失は進行性であるため、骨病変形成にかかわる分子の同定と新規機序による腫瘍抑制と骨病変を抑制する治療法の開発が喫緊の課題である。申請者は新たな骨病変形成因子の同定とともに新たな腫瘍バイオマーカータンパクの探索を行い、新規骨形成抑制因子NEO1を同定した。そこで本研究では、NEO1の骨芽細胞分化抑制機序および腫瘍細胞からの産生機序を解明する。さらに、患者血清中のNEO1濃度を計測し、骨病変との関連を臨床病理学的に解析し、バイオマーカーとしての可能性を検討する。
本研究では、新規骨形成抑制因子Neogenin1（NEO1）の骨芽細胞分化抑制機序および腫瘍細胞からの産生機序を解明し、腫瘍による骨病変形成の病態解明および新規治療法への開発へとつなげる。さらに、患者血清中のNEO1濃度を計測し、骨病変との関連を臨床病理学的に解析し、バイオマーカーとしての可能性を検討する。今年度の研究実績は以下のとおりである。①NEO1は神経突起伸長のガイダンス因子であるが、神経細胞株F11およびPC12に骨髄腫細胞の培養上清ならびにリコンビナントNEO1を添加したところ、神経突起の伸長が顕著に誘導された。②NEO1は接着分子のリガンドとして機能するが、その受容体としてNetrin1（NTN1）の発現を各種細胞で確認したところ、骨髄間質細胞に高発現することが明らかとなり、NTN1-NEO1を介した細胞間相互作用により、骨髄腫の増殖・薬剤耐性が誘導されることが示唆された。③NEO1ノックダウン骨髄腫細胞株を作成するために、骨髄腫細胞に導入するNEO1 shRNAコンストラクトを作成した。
2: おおむね順調に進展している
shRNAのコンストラクト作成に時間がかかったが、現在導入し、単クローン化を行っており、今年度は樹立した細胞を用いて解析ができるめどが立った。また申請にはなかった現象（NEO1の神経突起伸長誘導作用）が明らかとなり、本研究は多方面に広がっていくと考えられる。以上の点から、当初の予定通り研究が進捗していると評価できる。
今後は、骨髄腫由来のNEO1に機能について検討を行う。具体的には、NEO1ノックダウン（-KD）骨髄腫細胞骨髄腫培養上清を前骨芽細胞株MC3T3-E1を用いた骨芽細胞培養系に添加し、野生型骨髄腫培養上清と比較し骨芽細胞分化抑制が解除されるか検討する。野生型およびNEO1-KD骨髄腫細胞培養上清を採取し、骨芽細胞に作用させ、その分化に及ぼす影響を解析する。骨髄腫細胞における細胞外NEO1産生制御におけるTACE, TIMP-3の関与を検討する。具体的には、TACE阻害剤処理あるいはTACEおよびTIMP-3のshRNAを導入した骨髄腫細胞を培養し、上清中あるいは膜結合型NEO1 の発現量を野生型と比較し検討する。神経突起伸長に関しては、NEO1-KD骨髄腫細胞の培養上清を神経細胞に作用させ、野生型と比較して突起の伸長の誘導能を評価する。さらに、骨髄間質細胞のNTN1との相互作用も考えられるので、NEO1-KDと骨髄間質細胞を共培養し、MMの増殖や薬剤耐性について評価する。
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