研究課題/領域番号 |
22K19883
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研究種目 |
挑戦的研究(萌芽)
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配分区分 | 基金 |
審査区分 |
中区分64:環境保全対策およびその関連分野
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研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
研究代表者 |
栗原 恵美子 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 研究員 (90639585)
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研究期間 (年度) |
2022-06-30 – 2024-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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配分額 *注記 |
6,370千円 (直接経費: 4,900千円、間接経費: 1,470千円)
2023年度: 3,510千円 (直接経費: 2,700千円、間接経費: 810千円)
2022年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
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キーワード | ケミカルバイオロジー / メタボローム / 天然ゴム / シングルセルメタボローム / 培養細胞 |
研究開始時の研究の概要 |
我々の生活に欠かせない天然ゴムの生産について理解し,資源を守るために,本研究では,未分化なゴムノキの培養細胞に対して,低分子化合物処理やゴム合成関連遺伝子の導入を行い,対応する細胞内代謝物質プロファイルを取得することで未分化培養細胞内にゴム粒子を誘導すること,ひいてはゴム合成メカニズムの一端の解明を試みる.
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研究実績の概要 |
本研究では,未分化なゴムノキの培養細胞に対して,低分子化合物処理とゴム合成に必須な遺伝子の導入を行っていき,対応する細胞内代謝物質プロファイルを取得することで未分化培養細胞内にゴム粒子を誘導することを試みることを目的としている。 これまでに低分子化合物の候補としてはA2を選抜している.A2の作用機構を推定するためにA2処理時のトランスクリプトームおよびメタボローム解析を行ってきたが,より詳細なA2の作用について検討するために,今年度はA2処理時のプロテオーム解析を行い,現在データを解析している。 ゴム合成関連遺伝子<I>CPT,CPTL,REF,SRPP</I>にそれぞれ蛍光タンパク質遺伝子を融合させたものをパーティクルガン法で遺伝子導入し、それぞれのタンパク質の局在および挙動を解析した.小胞体との共局在を確認するためにHDEL配列に蛍光タンパク質を融合させたコンストラクトとCPT1をパーティクルガン法で同時に細胞に導入発現させたところ,局在が一致していた.よってゴム培養細胞においてCPT1は小胞体に局在している可能性が示唆された.並行して、ゴムゲノムデータベースのアップデートにより、CPTLの配列がこれまで扱っていた配列と異なることが明らかになった.そこで,新規配列に蛍光タンパク質遺伝子を融合させたコンストラクトを作成した.再度,局在と挙動を観察した結果,CPT1とCPTLだけを導入した細胞においては時間経過に伴いCPTとCPTLの局在が一致しなくなるのに対し,REFを追加して導入するとCPT1,CPTLの局在が小胞体にとどまることがが分かった.当初の計画ではこの遺伝子導入した細胞のシングルセルメタボロームを行う予定だったが,必要量のサンプルが取得できないため,今年度はゴム培養細胞の恒常的な形質転換の確立を試みる予定である.
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
おおむね順調にゴム合成関タンパク質の局在や挙動を解析してきたが,並行して行われていたパラゴムノキのゲノムデータベースにアップデートがあり,ゴム合成関連タンパク質遺伝子の配列が変更となるものがあった.それらについては再度遺伝子配列の確認からやり直しを行ったため,遅れが生じた.また,目的遺伝子を一過的に導入した細胞のみのメタボロームを行うための予備実験を行ったが,サンプル量の不足のため,測定不能であった.バルク細胞を対象としたメタボローム解析を行うために、ゴム培養細胞の形質転換技術の確立を行う必要が出てきたため,その時間を要する.
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今後の研究の推進方策 |
目的であるゴム合成関連遺伝子が導入された細胞についてのみのシングルセルメタボローム解析を行う予定で蛍光が確認できた細胞のサンプリングを行っていたが,メタボローム解析の処理の段階でサンプル量がある程度必要であることが分かった.当初蛍光が確認できた細胞を200-300細胞回収する予定であったが,パーティクルガン法による遺伝子の導入効率が悪く,ゴムノキ培養細胞を用いた恒常的な形質転換技術の確立およびバルクの目的細胞を対象としたメタボローム解析に変更した方が効率的に目的を達成できると考えた.そのため,ゴム培養細胞の恒常的な形質転換を試みる.形質転換技術を確立した後,目的の遺伝子を導入した培養細胞においてメタボローム解析を行うことを計画している.
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