| 研究課題/領域番号 |
22K19900
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| 研究種目 |
挑戦的研究(萌芽)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
中区分90:人間医工学およびその関連分野
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
大石 芳江 順天堂大学, 革新的医療技術開発研究センター, 特任研究員 (90648130)
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| 研究期間 (年度) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
6,240千円 (直接経費: 4,800千円、間接経費: 1,440千円)
2024年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
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| キーワード | ヒトES細胞 / 赤芽球 / 赤血球 / 分化誘導 / ヒトE細胞 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
申請者は、ヒト胚性幹 (ES)細胞から赤血球製剤を作製し、再生医療等製品としての実用化を目指している。本申請では、順天堂大学で所有するヒトES細胞 7株 (SEES 1～7)について赤芽球への分化指向性の高い株を選定し、ヒトＥＳ細胞由来赤芽球の培養プロトコルの確立及び機能評価を実施する。また、赤血球製剤として安定供給するための方法として、分化誘導方法の最適化、増殖期間の制御、および凍結保存の可能性について検討する。
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| 研究実績の概要 |
本研究は、ヒトES細胞を出発原料として赤芽球を効率的に分化誘導するための技術および製造した赤芽球の効率的な増殖法、凍結保存法を開発すること、さらに製造した赤芽球を脱核して得られた赤血球を多角的に評価し、安定的に輸血用血液を供給する仕組みを構築することを目的としている。
今年度は、1) 原料とするヒトES細胞株の候補として昨年度選定したROCK阻害剤要求性の低い株についてマウスES細胞の分化誘導方法の応用を試みた。2) 昨年度より引き続きマウスES細胞を用いた赤芽球への分化誘導法を検討し、分化の各段階での凍結保存法、赤血球への脱核法を決定した。
1)では、マウスES細胞で開発した赤芽球の分化誘導法に従い、OP9細胞との共培養によって造血幹細胞様の細胞塊を得た。その後、その細胞塊の浮遊培養を実施したが、マウスES細胞のように順調な増殖はみられず、赤芽球への分化誘導には至っていない。原因としては、増殖培地と分化培地の組成または浸透圧の違いが影響している可能性が考えられる。2)では、マウスES細胞をOP9細胞との共培養によって作製した細胞塊を長期間浮遊培養することによって、次に実施するOP9細胞と再共培養の後に得られる赤芽球様細胞が発現するglobin遺伝子が成人型を示すことについて再現性を確認した。また、その細胞の凍結保存法について、造血幹細胞の凍結保存用に開発された市販の数種類の凍結保存液および、申請者の所属する研究室で作製する凍結保存液の使用を検討し、K社製 C液を使用することによって、最も優れた解凍後の生存率を示すことを確認した。一方で、再共培養時に同時に得られる接着細胞については市販の汎用動物細胞の凍結保存液を用いて効率のよい凍結保存および解凍が可能であることを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ヒトES細胞の赤芽球への分化は、OP9細胞との共培養の工程以降の進捗がない。ヒトES細胞はマウスES細胞と異なり、非常にストレスに弱く、通常の細胞培養操作では簡単に細胞死を起こすため、培養の継続が困難であった。そのため、マウスES細胞では効率の良い赤芽球の分化誘導法が確立できているが、ヒトES細胞への応用が進んでいない。
他のヒトES細胞株を原料として使用すべく拡大培養を実施している。また、マウスES細胞の実験で使用している分化培地および増殖培地は汎用性のものを使用しており、同等の浸透圧であると考えられるが、ヒトES細胞で使用する増殖培地は、浸透圧が培養に最適化されているため、マウスES細胞で使用している分化培地と異なることが予想される。そこで、ヒトES細胞の増殖培地を基本として分化培地として使用できるよう改変を検討している。
また、マウスES細胞から分化誘導した赤芽球の脱核については、OP9細胞との再共培養後に浮遊してくる赤芽球様細胞を回収し、添加するサイトカイン組成をそれまでと変更して培養することで赤血球様細胞を得ており、問題なく脱核へ進行することを確認している。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、分化誘導に着手していないヒトES細胞 6株について拡大培養を継続し、赤芽球を製造するための出発原料として保管する。それらの細胞の性質を生化学的、分子生物学的手法によって解析した後、赤芽球への分化指向性の高い株を選定し、マウスES細胞にて得られた分化誘導法の知見を基に赤芽球への分化を検討する。
マウスES細胞からの赤血球への分化誘導方法は、ほぼ確立されたため、得られた赤血球の評価をメイ グリュンワルド ギムザ 染色法、フローサイトメトリー法を用いて実施する。また、赤血球を含む細胞培養液は、未分化のES細胞や脱核によって生じた核成分が残留しているため、赤血球を高純度に含む溶液に精製するための方法を検討する。
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