| 研究課題/領域番号 |
22K20621
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| 研究種目 |
研究活動スタート支援
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
0701:分子レベルから細胞レベルの生物学およびその関連分野
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
山内 彩加林 北海道大学, 低温科学研究所, 助教 (00951394)
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| 研究期間 (年度) |
2022-08-31 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | 冬眠 / 低温耐性 / シリアンハムスター / ビタミンE / α-トコフェロール輸送タンパク質 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
冬眠する哺乳類であるシリアンハムスターは、ビタミンEの一種であるα-トコフェロール (αT)を身体に高濃度に蓄積し低温耐性を獲得する。しかし、ハムスターの低温耐性に重要なαTの蓄積・全身分配の分子メカニズムは不明である。本研究では、ハムスターの高濃度αT蓄積・全身への輸送機構にαT輸送タンパク質(alpha-tocopherol transfer protein: TTPA)が果たす役割の解明を目指す。その為に、①ハムスターTTPAの分子特性を明らかにする。②ゲノム編集技術を用いてTTPA遺伝子ノックアウトハムスターを作製し、冬眠する哺乳類の低温耐性へのTTPAの関与を検証する。
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| 研究実績の概要 |
冬眠する哺乳類は、ヒトが生存困難な低体温状態でも生存可能な低温耐性を有するが、この低温耐性の仕組みは未だ殆ど不明である。我々の先行研究で、冬眠する哺乳類シリアンハムスターの肝細胞は、ビタミンEの一種であるα-トコフェロール(αT)を高濃度に蓄積することで低温耐性を発揮することが見出された。αTはハムスターの血中や他の臓器でもマウスに比して非常に高濃度で確認されることから、全身へのαTの分配・蓄積機構が全身の細胞・臓器の低温耐性に重要な役割を果たすことが予想される。しかし、 このαTの全身分配・蓄積の分子メカニズムはハムスターでは殆ど不明である。αTはヒト・ マウスではαT輸送タンパク質(alpha-tocopherol transfer protein: TTPA)により肝臓から血流に分泌され全身に分配される。我々はハムスターのTTPAが他の哺乳類のTTPAと多くの点で異なることを見出した。本研究の目的は、ハムスターTTPAの機能解析を通じて、αT蓄積・全身への輸送機構の分子メカニズムを理解することである。そのために、①ハムスターTTPAと他の哺乳類のTTPAの分子性質の違いの解明と、②ハムスターの低温耐性にTTPAが果たす役割の理解、の2つの研究方針で進めている。
初年度は、ハムスターTTPAの多量体形成能について検証を進めた。また、ハムスターの低温耐性にTTPAが果たす役割の理解を目指し、初年度に新規導入したゲノム編集技術：脂質ナノパーティクル(LNP)-CRISPR/Cas9システム系の立ち上げも進み、動物や細胞での条件検討段階に入っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の目的は、ハムスターTTPAの機能解析を通じて、αT蓄積・全身への輸送機構の分子メカニズムを理解することである。そのためには、ハムスターTTPAの分子としての性状を明らかにすることと、ハムスターにおけるTTPAの低温耐性における役割の理解が必要である。
採択初年度の本年度は、①ハムスターTTPAの分子特性を明らかにするために、まず多量体形成能の解析を行った。精製したハムスター・マウスTTPAをNative-PAGEおよびゲルろ過カラムクロマトグラフィーに供した結果、多量体のサイズが異なることが示唆された。ヒトTTPAは単量体に比べ多量体でαT輸送能が向上するという報告がある。ハムスターTTPAの多量体形成能とαT輸送能の関係をより詳細に調べるために、比較対象としてヒトTTPAの組換えタンパク質を新たに作製し、現在比較解析中である。
②ハムスターにおけるTTPAの低温耐性における役割の理解を目指し、脂質ナノパーティクル(LNP)とCRISPR/Cas9システムを組み合わせた遺伝子ノックアウトハムスター/肝細胞の系立ち上げを進めた。ハムスターはマウスの5倍以上の個体サイズを有し、必要となるゲノム編集試薬の量も多くCas9の組換え体を自作した。自作Cas9は、in vitroおよびin vivo（マウス）で市販品と同等の標的DNA切断活性を示した。自作Cas9を用い、LNP-CRISPR/Cas9システムによるハムスターおよび初代肝細胞の遺伝子ノックアウトが可能かどうか検討中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
ハムスターTTPAの分子性状解析を続ける。具体的には、ハムスターTTPAのαTや脂質との結合能を解析する。また、ハムスターTTPAの多量体形成能およびαT輸送能について、ヒトTTPAのそれと比較する。さらに、ハムスターにおけるTTPAの低温耐性における役割の理解を目指し、ハムスターおよびその肝細胞のノックアウトの条件検討およびαT量の測定を進める。
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