| 研究課題/領域番号 |
22K20632
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| 研究種目 |
研究活動スタート支援
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
0701:分子レベルから細胞レベルの生物学およびその関連分野
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
堤 尚孝 岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (70963495)
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| 研究期間 (年度) |
2022-08-31 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | クライオEM / 膜タンパク質 / 受容体 / 苦味 / TAS2R / GPCR / クライオ電子顕微鏡 / 構造生物学 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
苦味感覚は、生物が備える味覚の中でも、元来、毒物を判別するために進化してきたとされる。苦味受容体（Taste 2 Receptor: TAS2R）は、クラスTとして独立のグループを形成するGタンパク質共役受容体（GPCR）であり、ヒトは数千種類の苦味物質を、わずか25種類のTAS2Rで認識している。本研究では、この現象の分子機構と生理学的意義を解明する第一歩として、高品質組み換え発現TAS2Rの大量調製法を確立した上で、苦味物質群との結合実験を含めた物理化学的解析に取り組む。さらには、細胞内のシグナル伝達物質であるGタンパク質との安定複合体を精製し、立体構造・活性化機構解明への基盤とする。
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| 研究実績の概要 |
苦味受容体（Taste 2 Receptor: TAS2R）はクラスT型として独立のグループを形成するGタンパク質共役型受容体（GPCR）であり、ヒトは数千種類の苦味物質を、わずか25種類のTAS2Rで認識している。本研究では、この現象の分子機構と生理学的意義を解明するための第一歩として、高品質組み換え発現TAS2Rの大量調製法を確立した上で、苦味物質群との結合実験を含めた物理化学的解析に取り組むことを目的としている。
本年度は、まず1)物理化学的解析に必要な組換えTAS2Rの生産、および2)解析系の立ち上げ、の2つを目指して研究を行った。1)に関して、Expi293細胞を用いた一過性恒常発現系を用いてタンパク質の発現とその後の精製を試みたが、十分な収量を得ることができなかった。2)に関して、TAS2Rと異なるファミリーに属する味覚関連受容体などをモデルシステムとしてアッセイ系と単粒子クライオ電子顕微鏡法を用いた構造解析系の立ち上げを進めた。
2)に関しては、主に利用講習を終えたSPpring-8構造生物学推進室の施設にて、クライオ電子顕微鏡グリッドの作製と画像データの収集を行い、得られたデータの解析を行なった。これによって、必要なサンプルが得られ次第にクライオ電子顕微鏡を用いた構造解析を進める下地ができた。
一方で、当該分野では2022年9月にTAS2RのひとつであるTAS2R46と苦味物質（ストリキニーネ）のクライオ電子顕微鏡構造が報告されたため、優先ターゲットとするTAS2Rを変更するなど計画の修正が必要であると考える。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
現在のところ、十分な量・質の目的タンパク質を得られていないため、このように自己評価した。一方で、解析に必要な系の立ち上げは徐々に進めることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
一過性恒常発現系を用いたタンパク質の生産が思うように進まなかったため、これを一過性誘導発現に切り替えることとした。そのため、令和５年度にExpi293 Inducible Expression Systemの導入を予定している。また、高発現を達成するためにT2Rと可溶性分子との融合タンパク質の設計を進める。目的タンパク質が得られ次第、構築した系を用いて速やかに構造解析などを進める。
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