| 研究課題/領域番号 |
22K20659
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| 研究種目 |
研究活動スタート支援
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
0702:細胞レベルから個体レベルの生物学およびその関連分野
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
三田 真理恵 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究員 (20964878)
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| 研究期間 (年度) |
2022-08-31 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | ライブイメージング / 蛍光タンパク質 / 蛍光タンパク質センサー / バイオセンサー / プローブ / 脳 / 神経 / 脂質アンカー |
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| 研究開始時の研究の概要 |
脳を構成する神経細胞同士の隙間にある生体分子が、脳機能を調節していることが明らかになりつつある。例えばある神経疾患に伴う細胞間隙のイオン濃度の異常は、広範囲にわたる神経活動の一時的な不活性化と、その空間伝播を引き起こす。この現象は拡延性抑制と呼ばれるが、その伝播機構は不明である。本研究課題では、神経細胞間隙の様々な生体分子の動態を可視化する蛍光タンパク質型プローブと、プローブを発現するマウス脳スライス標本を用い、拡延性抑制の伝播を担う細胞外分子の動態を可視化解析し、神経疾患の伝播機序の解明に貢献する。
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、蛍光タンパク質センサーを用いたライブイメージングで、細胞間隙に存在する分子の動態解析を達成することである。本年度は、細胞外分子の可視化技術基盤の確立と、マウス脳スライス標本での解析を目指し、研究計画に従って以下の三項目を遂行した。
1)昨年に引き続き、遺伝子導入して蛍光タンパク質センサーを細胞膜外葉上に提示させる手法を検討した。それぞれのセンサーのC末端に、血小板由来増殖因子受容体の膜貫通ドメイン配列またはGPIアンカー配列を付加した。これらの遺伝子をHEK293細胞に導入したところ、GFPおよび一部のセンサーでは細胞膜上での発現が確認できた一方、細胞内で凝集体を形成するなど、細胞膜上での蛍光が確認できないセンサーがあった。蛍光タンパク質センサーの大きさが膜上で発現させる際の問題となる可能性が示唆された。
2)上記の試行と並行して、遺伝子導入を行わず、細胞外から添加して蛍光タンパク質センサーを細胞膜外葉上に提示させる手法を検討した。この手法には、脂質とポリエチレングリコールから成り、末端にNHSをもつ誘導体を用いた。この誘導体と、大腸菌を用いて合成・精製したセンサータンパク質を反応させ、N末端が修飾されたセンサータンパク質を得た。この脂質修飾センサーを細胞外から添加し、洗浄後に観察したところ、細胞外での蛍光を確認した。このことから、化学修飾により蛍光タンパク質センサーを細胞膜上に提示できることが明らかになった。
3)2)で作成した脂質修飾センサーを用い、マウス海馬スライスでの観察を試みた。海馬スライスに脂質修飾あり/なしのセンサータンパク質をそれぞれ添加した。洗浄後に顕微鏡下で観察したところ、脂質修飾した蛍光タンパク質センサーのみで細胞外での蛍光を観察した。この海馬スライス標本を用い、拡延性抑制にともなう細胞間隙の分子濃度の時間・空間変化を観察する予定である。
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