研究課題/領域番号 |
22K20882
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研究種目 |
研究活動スタート支援
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配分区分 | 基金 |
審査区分 |
0902:内科学一般およびその関連分野
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研究機関 | 新潟大学 |
研究代表者 |
安藤 昭一朗 新潟大学, 医歯学総合病院, 助教 (10918428)
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研究期間 (年度) |
2022-08-31 – 2024-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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配分額 *注記 |
2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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キーワード | 脳小血管病 / RVCL / TREX1 / DNA損傷 / 細胞老化 |
研究開始時の研究の概要 |
Retinal vasculopathy with cerebral leukoencephalopathy(RVCL)は、40代前後で発症し、約10年の経過で死亡する、遺伝性脳小血管病である。原因遺伝子は、three-prime repair exonuclease 1(TREX1)遺伝子である。申請者は、これまでに、ヒト細胞モデルにおいてRVCL変異TREX1が、核内局在とエキソヌクレアーゼ活性に依存したDNA切断損傷と細胞毒性をもたらすことを見出した。本研究では、ショウジョウバエモデルのRNAiスクリーニングで見出した、表現型抑制候補遺伝子がヒト遺伝子種で治療標的となり得るか検証する。
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研究実績の概要 |
本研究の目的は、Retinal vasculopathy with cerebral leukoencephalopathy(RVCL)疾患変異TREX1による細胞毒性を低減するヒト遺伝子種を同定することである。この背景には、RVCL疾患変異TREX1が、DNA切断損傷を誘導し、細胞毒性を引き起こすことがある。 RVCLショウジョウバエモデルを用いた、RNAiスクリーニングで見出した、表現型抑制遺伝子4種のヒトホモログ遺伝子が、RVCLヒト細胞モデルにおいて細胞毒性を抑制し得るかを検討した。 まず、HEK293細胞株を対象に、Flp-in systemを用いて、RVCL疾患変異であるp.Val235GlyfsTer6(V235fs)ヒトTREX1遺伝子を挿入し、RVCLヒト細胞モデルを作製した。このモデル細胞はドキシサイクリン誘導性に変異TREX1を発現する。 次に、このモデル細胞に、表現型抑制候補遺伝子のshort hairpin RNA(shRNA)をレンチウイルスベクターを用いて導入した。shRNAによる遺伝子発現抑制効果は、droplet digital PCR(ddPCR)によって発現量解析を行った。いずれの遺伝子も発現抑制できていることを確認した。 そして、このshRNAを導入したRVCLヒト細胞モデルを対象に、ToxiLight bioassayを用いて、表現型抑制候補遺伝子の抑制により、RVCL疾患変異TREX1による細胞毒性が低減するか検証した。結果、候補遺伝子4種のうち、2種の遺伝子において、ネガティブコントロールと比較して、shRNA導入群での細胞死率が低下した。従って、これらの2遺伝子が、ヒト細胞においてもRVCL疾患変異TREX1の細胞毒性を低減させる可能性が示唆された。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
RVCLヒト細胞モデルの作製とshRNAによる目的遺伝子の発現抑制は円滑に進み、細胞毒性緩和効果の検証実験に移行することができた。 結果、ショウジョウバエモデルで見出した表現型抑制候補遺伝子4種から、ヒト細胞でも細胞毒性を低減し得る遺伝子の候補を2種に絞ることができた。
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今後の研究の推進方策 |
RVCLヒト細胞モデルの細胞毒性を低減し得る候補遺伝子2種について、その他の細胞毒性アッセイでも評価をする。 また、細胞毒性低減の機序として、RVCL疾患変異TREX1によるDNA損傷の緩和が起きているか検討する。
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