プロテアーゼ恒常発現系を利用した高効率ウイルス分離法の開発

• 研究課題/領域番号: 22KJ0023
• 補助金の研究課題番号: 21J21075 (2021-2022)
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 基金 (2023); 補助金 (2021-2022)
• 応募区分: 国内
• 審査区分: 小区分58020:衛生学および公衆衛生学分野関連:実験系を含む
• 研究機関: 大阪公立大学 (2023); 北海道大学 (2021-2022)
• 研究代表者: 岸本 麻衣 大阪公立大学, 大学院獣医学研究科, 助教
• 研究期間 (年度): 2023-03-08 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2023年度)
• 配分額: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円); 2023年度: 700千円 (直接経費: 700千円); 2022年度: 700千円 (直接経費: 700千円); 2021年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
• キーワード: プロテアーゼ依存性ウイルス / ウイルス分離 / 人獣共通感染症 / ロタウイルスA / 脳心筋炎ウイルス / コウモリ / マストミス

研究開始時の研究の概要

近年、メタゲノム解析手法の普及により、様々な検体から膨大な数の新規ウイルスゲノムが検出されている。しかし、そのような新規ウイルスの多くは感染性ウイルス粒子が分離されておらず、病原性等の生物学的性状解析、中和抗体検出による疫学調査等によるリスク評価が困難である。
本研究では、宿主プロテアーゼ依存性ウイルスに着目し、高効率なウイルス分離法を開発する。この方法では、宿主プロテアーゼを恒常発現する細胞株の作成および次世代シークエンサー解析による網羅的な分離ウイルス検出により、ウイルスの分離効率を高める。さらに、開発した手法により多数の野生動物検体からウイルスを分離し、性状解析を実施する。

研究実績の概要

本研究では、プロテアーゼ依存性ウイルスを主な標的として、宿主プロテアーゼを発現する細胞を用いたウイルス分離と次世代シークエンサーによる網羅的ウイルス検出を組み合わせたスクリーニング系を構築し、ザンビアで採取された野生動物合計約400検体からウイルス分離を実施し、脳心筋炎ウイルスおよびロタウイルスA（RVA）を分離した。
本年度は、コウモリおよび齧歯類動物から分離されたRVAの性状解析を実施した。近年、一部の分節でコウモリや齧歯類由来のRVAと類似した遺伝子型をもつRVAがヒトから検出されており、コウモリと齧歯類動物のRVAの人獣間伝播の可能性が懸念されている。しかし、これらの報告はゲノム解析にとどまるものが多く、ウイルスの分離及び性状解析はほとんど実施されていない。まず、全分節の遺伝子配列情報を決定し、遺伝子再集合の評価、および系統学的解析により、特徴的な進化系統を有することを明らかにした。続いて、RVAが細胞侵入する際の接着因子である細胞表面糖鎖とRVAの結合性を調べた結果、16-06株は細胞表面のシアル酸と結合して細胞内に侵入する一方、MpR12株はシアル酸とは結合しないことが明らかになった。さらに、乳飲みマウスへの経口接種により分離株の病原性を評価した結果、16-06株およびMpR12株はどちらも乳飲みマウスに感染し、下痢を引き起こすことが示された。また、3次元再構築したヒト初代腸管上皮に対するRVAの感染性を調べた結果、16-06株およびMpR12株は、ヒト由来RVA Wa株と同等の効率で感染増殖することが明らかになった。本研究では、特徴的な遺伝学的背景を有するコウモリおよび齧歯類由来RVAのウイルス学的性状を、それらのRVAが人獣共通感染症となる可能性についてさらなる調査が必要であることが示唆された。

研究成果

• [雑誌論文] Combination therapy with oral antiviral and anti-inflammatory drugs improves the efficacy of delayed treatment in a COVID-19 hamster model (2024)
  • 著者名/発表者名: Sasaki M, Sugi T, Iida S, Hirata Y, Kusakabe S, Konishi K, Itakura Y, Tabata K, Kishimoto M, Kobayashi H, Ariizumi T, Intaruck K, Nobori H, Toba S, Sato A, Matsuno K, Yamagishi J, Suzuki T, Hall WW, Orba Y, Sawa H.
  • 雑誌名: eBioMedicine 巻: 99 ページ: 104950-104950
  • DOI: 10.1016/j.ebiom.2023.104950
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Comparative pathogenicity of SARS-CoV-2 Omicron subvariants including BA.1, BA.2, and BA.5 (2023)
  • 著者名/発表者名: Tamura T, Yamasoba D, Oda Y, Ito J, Kamasaki T, Nao N, Hashimoto R, Fujioka Y, Suzuki R, Wang L, Ito H, Kashima Y, Kimura I, Kishimoto M, Tsuda M, Sawa H, Yoshimatsu K, Yamamoto Y, Nagamoto T, Kanamune J, Suzuki Y, Ohba Y, et al.
  • 雑誌名: Communications Biology 巻: 6 号: 1 ページ: 772-772
  • DOI: 10.1038/s42003-023-05081-w
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Impact of Imprinted Immunity Induced by mRNA Vaccination in an Experimental Animal Model (2023)
  • 著者名/発表者名: Fujita S, Uriu K, Pan L, Nao N, Tabata K, Kishimoto M, Itakura Y, Sawa H, Kida I, Tamura T; Genotype to Phenotype Japan (G2P-Japan) Consortium; Fukuhara T, Ito J, Matsuno K, Sato K.
  • 雑誌名: The Journal of Infectious Diseases 巻: 228 号: 8 ページ: 1060-1065
  • DOI: 10.1093/infdis/jiad230
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Development of flavivirus subviral particles with low cross-reactivity by mutations of a distinct antigenic domain (2023)
  • 著者名/発表者名: Tabata K, Itakura Y, Ariizumi T, Igarashi M, Kobayashi H, Intaruck K, Kishimoto M, Kobayashi S, Hall WW, Sasaki M, Sawa H, Orba Y.
  • 雑誌名: Applied Microbiology and Biotechnology 巻: 107 号: 24 ページ: 7515-7529
  • DOI: 10.1007/s00253-023-12817-5
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Morphogenesis of bullet-shaped rabies virus particles regulated by TSG101 (2023)
  • 著者名/発表者名: Yukari Itakura, Koshiro Tabata, Takeshi Saito, Kittiya Intaruck, Nijiho Kawaguchi, Mail Kishimoto, Shiho Torii, Shintaro Kobayashi, Naoto Ito, Michiko, Harada, Satoshi Inoue, Ken Maeda, Ayato Takada, William W. Hall, Yasuko Orba, Hirofumi Sawa, Michihito Sasaki
  • 雑誌名: Journal of Virology 巻: － 号: 5
  • DOI: 10.1128/jvi.00438-23
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Isolation and Characterization of Distinct Rotavirus A in Bat and Rodent Hosts (2023)
  • 著者名/発表者名: Kishimoto M, Kajihara M, Tabata K, Itakura Y, Toba S, Ozono S, Sato Y, Suzuki T, Ito N, Changula K, Qiu Y, Mori-Kajihara A, Eto Y, Harima H, Mwizabi D, Hang’ombe BM, Hall WW, Takada A, Orba Y, Sawa H, Sasaki M
  • 雑誌名: Journal of Virology 巻: 97 号: 1
  • DOI: 10.1128/jvi.01455-22
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] S-217622, a SARS-CoV-2 main protease inhibitor, decreases viral load and ameliorates COVID-19 severity in hamsters (2022)
  • 著者名/発表者名: Michihito Sasaki, Koshiro Tabata, Mai Kishimoto, Yukari Itakura, Hiroko Kobayashi, Takuma Ariizumi, Kentaro Uemura, Shinsuke Toba, Shinji Kusakabe, Yuki Maruyama et al.
  • 雑誌名: Science Translational Medicine 巻: 15(679) 号: 679
  • DOI: 10.1126/scitranslmed.abq4064
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Virological characteristics of the SARS-CoV-2 Omicron BA.2 subvariants, including BA.4 and BA.5 (2022)
  • 著者名/発表者名: Kimura et al.
  • 雑誌名: Cell 巻: 185 号: 21 ページ: 3992-4007
  • DOI: 10.1016/j.cell.2022.09.018
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Isolation and characterization of an orthoreovirus from Indonesian fruit bats (2022)
  • 著者名/発表者名: Intaruck Kittiya、Itakura Yukari、Kishimoto Mai、Chambaro Herman M.、Setiyono Agus、Handharyani Ekowati、Uemura Kentaro、Harima Hayato、Taniguchi Satoshi、Saijo Masayuki、Kimura Takashi、Orba Yasuko、Sawa Hirofumi、Sasaki Michihito
  • 雑誌名: Virology 巻: 575 ページ: 10-19
  • DOI: 10.1016/j.virol.2022.08.003
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] A comprehensive list of the Bunyavirales replication promoters reveals a unique promoter structure in Nairoviridae differing from other virus families (2022)
  • 著者名/発表者名: Yutaro Neriya, Shohei Kojima, Arata Sakiyama, Mai Kishimoto, Takao Iketani, Tadashi Watanabe, Yuichi Abe, Hiroshi Shimoda, Keisuke Nakagawa, Takaaki Koma, Yusuke Matsumoto
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 12 号: 1 ページ: 13560-13560
  • DOI: 10.1038/s41598-022-17758-z
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Serological characterization of lineage II insect-specific flaviviruses compared with pathogenic mosquito-borne flaviviruses (2022)
  • 著者名/発表者名: Tabata Koshiro、Itakura Yukari、Toba Shinsuke、Uemura Kentaro、Kishimoto Mai、Sasaki Michihito、Harrison Jessica J.、Sato Akihiko、Hall William W.、Hall Roy A.、Sawa Hirofumi、Orba Yasuko
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 616 ページ: 115-121
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2022.05.080
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Virological characteristics of the SARS-CoV-2 Omicron BA.2 spike (2022)
  • 著者名/発表者名: Yamasoba Daichi、Kimura Izumi、Nasser Hesham他
  • 雑誌名: Cell 巻: 未定 号: 12 ページ: 2103-2115
  • DOI: 10.1016/j.cell.2022.04.035
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Attenuated fusogenicity and pathogenicity of SARS-CoV-2 Omicron variant (2022)
  • 著者名/発表者名: Suzuki Rigel、Yamasoba Daichi、Kimura Izumi、Wang Lei他
  • 雑誌名: Nature 巻: 603 号: 7902 ページ: 700-705
  • DOI: 10.1038/s41586-022-04462-1
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Mastomys natalensis is a possible natural rodent reservoir for encephalomyocarditis virus (2021)
  • 著者名/発表者名: Kishimoto M, Hang'ombe BM, Hall WW, Orba Y, Sawa H, Sasaki M.
  • 雑誌名: J Gen Virol 巻: 102(3) 号: 3
  • DOI: 10.1099/jgv.0.001564
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] TMPRSS11D and TMPRSS13 Activate the SARS-CoV-2 Spike Protein (2021)
  • 著者名/発表者名: Kishimoto M, Uemura K, Sanaki T, Sato A, Hall WW, Kariwa H, Orba Y, Sawa H, Sasaki M.
  • 雑誌名: Viruses 巻: 13(3) 号: 3 ページ: 384-384
  • DOI: 10.3390/v13030384
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Host serine proteases TMPRSS2 and TMPRSS11D mediate proteolytic activation and trypsin-independent infection in group A rotaviruses. (2021)
  • 著者名/発表者名: Sasaki M, Itakura Y, Kishimoto M, Tabata K, Uemura K, Ito N, Sugiyama M, Wastika CE, Orba Y, Sawa H.
  • 雑誌名: J Virol 巻: - 号: 11
  • DOI: 10.1128/jvi.00398-21
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] SARS-CoV-2 Bearing a Mutation at the S1/S2 Cleavage Site Exhibits Attenuated Virulence and Confers Protective Immunity (2021)
  • 著者名/発表者名: Sasaki Michihito、Toba Shinsuke、Itakura Yukari、Chambaro Herman M.、Kishimoto Mai、Tabata Koshiro、Intaruck Kittiya、Uemura Kentaro、Sanaki Takao、Sato Akihiko、Hall William W.、Orba Yasuko、Sawa Hirofumi
  • 雑誌名: mBio 巻: 12 号: 4
  • DOI: 10.1128/mbio.01415-21
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Air-liquid interphase culture confers SARS-CoV-2 susceptibility to A549 alveolar epithelial cells (2021)
  • 著者名/発表者名: Sasaki Michihito、Kishimoto Mai、Itakura Yukari、Tabata Koshiro、Intaruck Kittiya、Uemura Kentaro、Toba Shinsuke、Sanaki Takao、Sato Akihiko、Hall William W.、Orba Yasuko、Sawa Hirofumi
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 577 ページ: 146-151
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2021.09.015
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] ザンビアのエジプトルーセットオオコウモリおよびマストミスから分離されたロタウイルスAの性状解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 岸本麻衣、梶原将大、高田礼人、大園誠也、鈴木忠樹 、伊藤直人、大場靖子、澤洋文、佐々木道仁
  • 学会等名: 第166回日本獣医学会学術集会
• [学会発表] SARS-CoV-2非構造タンパク質のアミノ酸配列が関与するCOVID-19重症化メカニズム (2023)
  • 著者名/発表者名: 岸本麻衣、鳥羽晋輔、上村健太朗、丸山優樹、日下部伸治、佐藤彰彦、大場靖子、澤洋文、佐々木道仁
  • 学会等名: 第70回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] 多様な哺乳類および鳥類デルタウイルスからサテライト/ヘルパーウイルスと宿主動物の共進化機構を紐解く (2023)
  • 著者名/発表者名: 岸本麻衣、川崎純菜、北尾晃一、堀江真行
  • 学会等名: NGS EXPO 2023
• [学会発表] 多様な哺乳類および鳥類デルタウイルスから紐解くサテライト/ヘルパーウイルスと宿主動物の共進化機構 (2023)
  • 著者名/発表者名: 岸本麻衣、川崎純菜、北尾晃一、堀江真行
  • 学会等名: 第46回日本分子生物学会年会
• [学会発表] ウイルス分離先行型スクリーニングにより分離された野生動物由来ロタウイルスAの性状解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 岸本麻衣、梶原将大、高田礼人、伊藤直人、大場靖子、澤洋文、佐々木道仁
  • 学会等名: 第69回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] SARS-CoV-2非構造タンパク質によって規定されるCOVID-19重症化の分子機構 (2022)
  • 著者名/発表者名: 岸本麻衣、鳥羽晋輔、上村健太朗、丸山優樹、日下部伸治、佐藤彰彦、大場靖子、澤洋文、佐々木道仁
  • 学会等名: 第45回日本分子生物学会年会
• [学会発表] ザンビアに生息する野生げっ歯類動物における脳心筋炎ウイルス（EMCV）の疫学調査 (2021)
  • 著者名/発表者名: 岸本麻衣、Bernard M. Hang’ombe、大場靖子、澤洋文、佐々木道仁
  • 学会等名: 第164回日本獣医学会学術集会
• [学会発表] SARS-CoV-2と宿主II型膜貫通型セリンプロテアーゼ（TTSP）の相互作用 (2021)
  • 著者名/発表者名: 岸本麻衣、上村健太朗、佐名木孝央、佐藤彰彦、大場靖子、澤洋文、佐々木道仁
  • 学会等名: 第68回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] SARS-CoV-2の感染を促進する宿主II型膜貫通型セリンプロテアーゼの同定 (2021)
  • 著者名/発表者名: 岸本麻衣、上村健太朗、佐名木孝央、佐藤彰彦、大場靖子、澤洋文、佐々木道仁
  • 学会等名: 第44回日本分子生物学会年会