研究課題/領域番号 |
22KJ0484
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補助金の研究課題番号 |
22J21148 (2022)
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研究種目 |
特別研究員奨励費
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配分区分 | 基金 (2023) 補助金 (2022) |
応募区分 | 国内 |
審査区分 |
小区分47030:薬系衛生および生物化学関連
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研究機関 | 千葉大学 |
研究代表者 |
鈴木 翔大 千葉大学, 医学薬学府, 特別研究員(DC1)
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研究期間 (年度) |
2023-03-08 – 2025-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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配分額 *注記 |
2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
2024年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2023年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2022年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
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キーワード | CADASIL / NOTCHシグナル / NOTCH3 / 血管平滑筋 / 細胞老化 / 脳微小環境 / Notchシグナル / 糖鎖修飾 / Fringe / ペリサイト |
研究開始時の研究の概要 |
遺伝性認知症CADASILの病因として、NOTCH3遺伝子の変異に加えて老化がある。これまでに血管周辺でのNOTCH3変異タンパクの蓄積が病態を進行させることが示唆されているが、老化が変異タンパクを蓄積させる分子機構は不明である。 申請者らは、NOTCH3変異タンパクがNOTCHの糖修飾酵素やリガンドによって引き起こされることを明らかにした。そこで、老化が糖修飾酵素やリガンドといったNOTCH3とは別の分子を介して、NOTCH3変異タンパクの蓄積を促すのではと考え、in vitro及びin vivo CADASILモデルを利用して、老化を介したNOTCH3変異タンパク蓄積機構の解明を目指す。
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研究実績の概要 |
当該年度は不死化血管平滑筋細胞imSMCのNOTCH3 CADASIL変異株の樹立、NOTCH3の分解、及び平滑筋の機能解析を並行して行なった。変異株の樹立について、CRISPR/Cas9システムによる相同組み換えを利用して、imSMCのNOTCH3遺伝子にCADASIL変異として報告されているC185RまたはR182Cを導入した。限界希釈によってホモ及びヘテロ変異株を樹立した。 次にNOTCH3 C185R, R182C変異体の分解を定量した。変異株を単独培養条件下および、 JAG1リガンド発現細胞との共培養条件下で培養後にシクロヘキシミドを添加することでNOTCH3の分解を追跡した。 さらに、コラーゲンゲル培養法を用いてimSMC NOTCH3 C185R, R182C変異株の収縮能を定量した。また、分化・増殖能を定量した。いずれの解析にしても細胞株のクローン差が生じてしまったので、今後は複数のクローンを用いて実験する必要がある。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当該年度は血管平滑筋細胞のCADASIL変異細胞株が樹立できて機能解析まで進めたが、細胞株のクローン差が出てしまったため。
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今後の研究の推進方策 |
複数クローンを採取して増殖能が同程度の細胞株で野生型とCADASIL変異型の機能を解析していく。
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