| 研究課題/領域番号 |
22KJ1686
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| 補助金の研究課題番号 |
21J21840 (2021-2022)
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 基金 (2023)
補助金 (2021-2022) |
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| 応募区分 | 国内 |
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| 審査区分 |
小区分44020:発生生物学関連
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
山本 琢人 京都大学, 農学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2023-03-08 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
2023年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
2022年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
2021年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
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| キーワード | 母性因子 / 胚性ゲノムの活性化 / 受精卵 / エレクトロポレーション / Pwp1 / Myc / GV期卵母細胞 / 卵丘細胞 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、卵母細胞内に蓄えられた母性因子と受精後に活性化される胚自身のゲノムに由来する胚性因子について、初期胚の発生と分化制御機構への影響について検討する。マウス初期胚では受精後母性因子は分解され、胚性因子の急激な発現により発生が進行するため、母性因子として発生に重要な役割を果たす母性効果遺伝子のノックダウン及び過剰発現を行い、発生、分化への影響を検討する。また、胚性因子については、複数のファミリー遺伝子が存在するため研究の進んでいなかったMycファミリーについて注目し、それらの遺伝子の同時ノックダウンを行うことで初期発生への影響を検討する。
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| 研究実績の概要 |
受精前のマウスGV期卵母細胞へ母性因子を標的としたsiRNAを導入しノックダウンする昨年度開発した手法を用いて、マウス初期胚発生におけるH3.3の役割の解析を行った。GV期卵母細胞へH3.3を標的としたsiRNAを導入した結果、7割以上のmRNAの分解が確認された。さらに、雄性前核ではH3.3タンパク質が取り込まれていないことが確認された。H3.3のmRNAが分解された胚では受精率に対照区との違いは見られなかったが、2細胞期への発生率が著しく低下したことから、受精後の発生には雄性前核へのH3.3タンパク質の取り込みが不可欠であることが明らかとなった。
胚性因子の解析については、昨年度に引き続きMycとPwp1に注目して研究を行った。
MycのmRNAを標的としたアンチセンスオリゴによりmRNAを分解した場合と、転写因子としての活性に必要なMYC-MAXの複合体形成を阻害剤により阻害した場合の両方において、マウス受精卵の発生は2細胞期で停止した。さらに、RNA-seqにより網羅的な遺伝子発現解析を行った結果、MYCの機能を阻害した胚では胚性ゲノムの活性化が阻害されていることが明らかとなった。
Pwp1については、受精から2時間後にエレクトロポレーションによってsiRNAを導入し、ノックダウンを行い、発生への影響を検討した。Pwp1は大規模な胚性ゲノムの活性化が起こる2細胞期後期に転写が行われており、Pwp1がノックダウンされた場合胚盤胞期への発生率が対照区の胚と比較して有意に低下し、分化に関わるマーカー遺伝子の発現に変化が見られた。さらに免疫蛍光染色の結果、PWP1タンパク質は2細胞期から核に局在し、胚盤胞期には将来胎児となる内部細胞塊に優先して局在することが明らかとなり、哺乳類の初期発生における最初の分化である内部細胞塊と栄養外胚葉への分化に関与していることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
GV期の卵母細胞は受精卵とは異なり卵丘細胞によって覆われているため、これまではsiRNAの導入による遺伝子発現の抑制は困難であったが、本研究によって簡便なsiRNAの導入手法の確立に成功し、実際にH3.3を標的としたノックダウン解析を行い、H3.3が雄性前核へ取り込まれることが発生において不可欠であることが示された。本手法は受精率や発生率を低下させることはなく、またエレクトロポレーション法は従来の顕微注入法とは異なり、高価なマイクロマニピュレーターや専門的な技術を必要としないため、今後は本研究による手法が普及することで容易に受精前後の遺伝子の機能解析が行われることが期待できる。
Pwp1は大規模な胚性ゲノムの活性化が起こる2細胞期後期に発現する遺伝子であるが、初期胚発生における機能は調べられていなかった。Pwp1を標的としたsiRNAを1細胞期胚へと導入し機能を阻害した場合、胚盤胞期への発生率が低下した。また、哺乳類の初期発生における最初の分化である内部細胞塊と栄養外胚葉への分化に関与していることが示されたことから、Pwp1は胚性因子として受精後に発現し、その後の発生と分化に重要な役割を持つことが明らかとなった。
Mycはマウス初期胚では2-4細胞期に特異的な転写を示しており、Mycファミリー遺伝子の機能を阻害するアンチセンスオリゴまたは阻害剤を用いた場合は、2細胞期で発生が停止した。さらに、4細胞期以降に同様の阻害剤処理を行った場合は発生率の低下は見られず、通常通り胚盤胞へと発生は進行した。RNA-seqによる解析ではMycが胚性ゲノムの活性化に必要であることが示唆された。これらのことから、マウス初期胚発生においてMycファミリー遺伝子は2細胞期から4細胞期への発生に限定して必要であることが明らかとなった。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでにエレクトロポレーション法を試みることでGV期の卵母細胞に対し、発生に悪影響を与えることなくsiRNAを安定して導入する手法の開発に成功し、実際にH3.3を発現抑制の標的として解析を行ったところ、2細胞期への発生率の低下や受精直後の前核への取り込みへの異常などの表現型が得られたことを報告している。また予備実験としてこの手法を用いて、Mater, Zar1, Brg1, Npm2等の母性効果遺伝子を標的としたsiRNAをGV期卵母細胞へと導入したところ、実際に発生異常を確認することができた。今後はさらにこれらの遺伝子について未知の生物学的機能を詳細に解析する。一方でsiRNAではなくmRNAを同様にエレクトロポレーション法により導入し、特定の遺伝子を過剰発現させる手法については、mRNAがsiRNAに比べ分子量が大きく取り込まれづらいようであり、分子量の大きさや電気条件の検討中である。
胚性因子については、Pwp1に対するsiRNAをマウス初期胚へ導入しノックダウンすることで胚盤胞期への発生率が有意に低下し、分化に関連した遺伝子の発現が異常となることが確認され、さらにはPWP1タンパク質が内部細胞塊へ選択的に局在していることが明らかとなったため、Pwp1が初期胚の発生と分化に及ぼす役割について解析を行う。また、Mycファミリー遺伝子についてはアンチセンスオリゴによるmRNA抑制と阻害剤によるタンパク質の機能阻害を行い、1細胞期以降の機能を阻害した結果、2細胞期で発生が停止することが確認されている。4細胞期以降の様々な発生時期にMYCタンパク質の機能を阻害剤によって阻害した場合は胚盤胞へと正常に発生は進行したことから、Mycファミリー遺伝子が2細胞期後期に起こる大規模な胚性ゲノムの活性化へ果たす役割に注目してRNA-seq等による解析を行う。
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