| 研究課題/領域番号 |
22KJ1996
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| 補助金の研究課題番号 |
22J23016 (2022)
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 基金 (2023)
補助金 (2022) |
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| 応募区分 | 国内 |
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| 審査区分 |
小区分38030:応用生物化学関連
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
鈴木 洋平 京都大学, 農学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2023-03-08 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
2024年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2023年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2022年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
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| キーワード | 酵素電極反応 / 直接電子移動 / 果糖脱水素酵素 / 生物電気化学 / 芳香族 / 構造生物学 / クライオ電子顕微鏡 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
酸化還元酵素反応と電極反応を共役させることで，バイオ電池やバイオセンサを構築できる．特に，直接電子移動（DET）型反応は種々の利点を有し，世界的に注目されている．一方，本反応が可能な酵素は報告例が少なく，メカニズムの詳細も不明である．そこで，高いDET型活性を持つ果糖脱水素酵素（FDH）に着目した．本研究では，FDHをモデル酵素として用いたDET型反応に関する基礎的検討を第一の目的とする．本知見の応用展開として，高出力バイオ電池の構築を第二の目的とする．本目的を達成するため，FDHの立体構造の解明と，酵素工学的手法による高活性変異体の作製を行う．
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| 研究実績の概要 |
酸化還元酵素と電極が直接的に電子授受を行う反応を直接電子移動（DET）型酵素電極反応と呼ぶ．本反応は系の複雑化や熱力学的エネルギーの損失等を回避できる理想的な反応系であり，次世代型バイオセンサ／バイオ燃料電池等への展開が期待できる．しかし，DET型反応を実現する酵素の報告例は少なく，そのほとんどにおける反応機構も不明である．本反応を精良なデバイスに幅広く適用するためには，新規DET型酵素の探索やDET型反応の詳細な機構解明が必須である．
本研究では，モデル酵素として，非常に高いDET型活性を有する酢酸菌由来の果糖脱水素酵素（FDH）に着目した．本酵素はテロ三量体膜タンパク質であり，触媒サブユニットに保有するフラビンで果糖の酸化を行い，シトクロム（C）サブユニットに保有するheme cで電子伝達および電極との電子授受を行う．一方，Cサブユニットを欠損させた変異体（ΔC FDH）は果糖酸化能を有するものの，平板金電極においてDET型活性を示さないことが報告されている．
昨年度は，電気化学および構造生物学的な観点から，FDHが有する優れたDET型触媒反応機構の要因究明を行った．その結果，酵素内部に存在する芳香族アミノ酸によって，酵素―電極間の電子移動が促進されていることが明らかになった．そこで本年度は，上記の知見に基づいて，芳香族化合物による電子移動促進効果に着目してΔC FDHのDET型反応実現を試みた．その結果，電荷を持たない芳香環を持つチオールを修飾した金電極上で，ΔC FDHのDET型触媒反応を実現することに成功した．さらに，電極に修飾されたチオール間の相互作用がΔC FDHのDET型触媒反応に与える影響を調査し，芳香族チオールによるDET型反応促進機構について考察した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題の目的は，DET型反応に必要な要素の探索と，本知見に基づく高性能な電気化学デバイスの作製である．昨年度，芳香族化合物がDET型反応を促進するという知見が得られたため，本年度は遺伝子工学的な手法を用いることで，酵素内部に芳香族アミノ酸を導入し，DET型反応の改善を志向した酵素を作製することを予定していた．しかし，このように酵素に変異導入を行う手法は，変異導入箇所を選定する際の難易度や，変異導入による酵素活性への影響を考慮すると，必ずしも最善の戦略とは言えない．そこで本年度は，電極に芳香族化合物を修飾することでDET型反応の向上を図るという，より簡便かつ普遍的な手法を試みた．その結果，芳香族チオールを修飾した金電極を用いることで，これまでは不可能であった酵素のDET型反応を実現することに成功した．このように，電気化学デバイスの性能改善につながる，DET型反応を向上させるための手法を新たに見出したという点で，今年度はおおむね順調に進展していると判断した．
これまで，酵素のDET型反応を向上させるための取り組みは世界中でなされてきたが，その大多数は，電極活性部位となる酵素のコファクターと電極の間の距離を短縮させることを目的として行われてきた．一方，本手法は，芳香族化合物の活用によるDET型反応の向上という，全く新しい戦略である．
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は，遺伝子工学的手法による高活性FDH変異体の創出と，本変異体を用いた高出力バイオ燃料電池の構築を予定している．本目的を達成するため，以下の実験を遂行する予定である．
（1）芳香族残基の導入による高活性変異体の作製
FDHの酵素内電子移動の律速段階となっているコファクター間に，一残基置換により芳香族残基を導入する．導入する芳香族残基の種類，または置換対象となる残基を変更した新規変異体を10種類程度作製し，酵素活性の上昇を図る．本検討と併せて，FDHの電極反応部位近傍に芳香族残基を導入することで，酵素―電極間の電子移動速度が向上した変異体の作製も目指す．
（2）高活性変異体を活用したバイオ燃料電池の構築
（1）で作製した新規FDH変異体を用いることで，陽極を高性能化し，既存技術である陰極と組み合わせ，バイオ燃料電池を構築する．本電池の出力は電極構造に影響されるため，電極材料や表面修飾方法等も併せて検討する．最終的には，一平方センチメートル当たり10 mWを超える出力密度を目指す．
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