リソファジーの新規評価系の開発及び分子機構の解明

• 研究課題/領域番号: 22KJ2105
• 補助金の研究課題番号: 22J00913 (2022)
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 基金 (2023); 補助金 (2022)
• 応募区分: 国内
• 審査区分: 小区分43030:機能生物化学関連
• 研究機関: 奈良県立医科大学 (2023); 大阪大学 (2022)
• 研究代表者: 志摩 喬之 奈良県立医科大学, 医学部, 助教
• 研究期間 (年度): 2023-03-08 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円); 2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: リソソーム / オートファジー / リソソーム損傷応答機構 / リソファジー / ユビキチン / リソソーム損傷応答経路 / オートファジー受容体タンパク質

研究開始時の研究の概要

現在、複数の経路が損傷リソソーム修復に関わることが報告されている。従ってリソファジーの分子機構を理解する上で、その活性を特異的に検出できる新規評価系は不可欠であり、それを用いた新規因子の網羅的探索と、解析が必須である。本研究では、①蛍光タンパク質mKeimaを用いた新規リソファジー評価系を開発し、②それを用いたsgRNAおよびsiRNAによる網羅的スクリーニングと、その候補因子の解析をおこなうことで、リソファジーの分子機構の解明に突破口を開くことを目的とする。さらには個体に対して開発した新規評価系を導入し、細胞で得られた分子機構の知見に基づき、③リソファジーの生理的意義の解明を試みる。

研究実績の概要

多数の加水分解酵素を含むリソソームは、細胞内外の物質の分解を担うオルガネラである。リソソームは細胞内外の様々な因子 (シリカ、酸化ストレス、尿酸結晶など)によって損傷を受けることが報告されているが、リソソームの内容物が細胞質に放出されることは、炎症、酸化ストレスなどを惹起し、細胞に害を及ぼす。
近年、損傷したリソソームの膜修復や除去に働く「リソソーム損傷応答経路」が複数見出された。その中の一つ、損傷したリソソームをオートファジーによって選択的に隔離する「リソファジー」も、細胞の恒常性維持において重要な役割を有する。しかしながら、損傷リソソームの認識機構や、リソファジーを駆動するタンパク質やその挙動の実態といった、リソファジーの分子機構に関する知見は未だ乏しい。
これまではリソファジーの定量的測定法として、損傷リソソームマーカーGalectin3の輝点形成及びその消失を指標に、損傷リソソームのクリアランスを計測していた。しかしながら従来の評価法ではリソファジーと他の損傷応答経路を区別することができない。
本研究では、pHにより励起波長が変化する蛍光タンパク質mKeimaを用い、リソファジーを評価するためのプローブを開発した。従来のアッセイ法と比較し、本プローブがよりリソソファジーを特異的に検出できることを実験的に証明した。加えて、このプローブを用いて、TFEBとp62がリソソーム損傷応答には重要であるが、リソファジーには重要ではないことを示した。さらに、このプローブを用いたミニスクリーニングにより、ユビキチン化に関与する因子UBE2L3、UBE2N、TRIM10、TRIM16、TRIM27がリソファジーに重要だということを見出した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

昨年度は、mKeimaを用いることで新規リソファジー評価系の構築に成功した。この新規評価系は従来の評価系と比べて、よりリソファジー特異的なアッセイ法である。本年度では、この新規プローブの詳細な評価をおこない、これまでリソファジーに機能すると考えられていたTFEBとp62が、リソファジーではなく、他の損傷応答経路に機能しうることを見出し、加えてリソファジーに重要なオートファジックアダプターの同定に成功した。さらに、リソファジーの初期段階に機能する因子（UBE2L3、UBE2N、TRIM10、TRIM16、TRIM27）の同定に成功した。以上のことから、本研究は概ね順調に進展していると考えられる。

今後の研究の推進方策

今後は、開発した新規プローブの、他のモデル生物への導入を試みる。
加えて今回同定した新規因子の詳細な解析を進めることで、リソファジーの分子メカニズムの解明を試みる。

研究成果

• [雑誌論文] HKDC1, a target of TFEB, is essential to maintain both mitochondrial and lysosomal homeostasis, preventing cellular senescence (2024)
  • 著者名/発表者名: 1.Cui, M., Yamano, K., Yamamoto, K., Yamamoto-Imoto, H., Minami, S., Yamamoto, T., Matsui, S., Kaminishi, T., Shima, T., Ogura, M., Tsuchiya, M., Nishino, K., Layden B., Kato, H., Ogawa, H., Oki, S., Okada, Y., Isaka, Y., Kosako, H., Matsuda, N., *Yoshimori, T., *Nakamura, S.
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 121 号: 2
  • DOI: 10.1073/pnas.2306454120
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] The TMEM192-mKeima probe specifically assays lysophagy and reveals its initial steps (2023)
  • 著者名/発表者名: Shima Takayuki、Ogura Monami、Matsuda Ruriko、Nakamura Shuhei、Jin Natsuko、Yoshimori Tamotsu、Kuma Akiko
  • 雑誌名: Journal of Cell Biology 巻: 222 号: 12
  • DOI: 10.1083/jcb.202204048
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Lysophagy protects against propagation of α-synuclein aggregation through ruptured lysosomal vesicles (2023)
  • 著者名/発表者名: Kakuda Keita、Ikenaka Kensuke、Kuma Akiko、Doi Junko、Aguirre Cesar、Wang Nan、Ajiki Takahiro、Choong Chi-Jing、Kimura Yasuyoshi、Badawy Shaymaa Mohamed Mohamed、Shima Takayuki、Nakamura Shuhei、Baba Kousuke、Nagano Seiichi、Nagai Yoshitaka、Yoshimori Tamotsu、Mochizuki Hideki
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 121 号: 1
  • DOI: 10.1073/pnas.2312306120
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Microautophagy regulated by <scp>STK38</scp> and <scp>GABARAPs</scp> is essential to repair lysosomes and prevent aging (2023)
  • 著者名/発表者名: Ogura Monami、Kaminishi Tatsuya、Shima Takayuki、Torigata Miku、Bekku Nao、Tabata Keisuke、Minami Satoshi、Nishino Kohei、Nezu Akiko、Hamasaki Maho、Kosako Hidetaka、Yoshimori Tamotsu、Nakamura Shuhei
  • 雑誌名: EMBO reports 巻: 24 号: 12
  • DOI: 10.15252/embr.202357300
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] mKeimaを用いたリソファジー特異的なアッセイ系の確立 (2022)
  • 著者名/発表者名: 志摩 喬之 , 久万 亜紀子 , 吉森 保
  • 学会等名: 第74回日本細胞生物学会大会