B型肝炎ウイルス侵入過程における受容体共役因子の役割と制御機構に関する研究

• 研究課題/領域番号: 22KJ2816
• 補助金の研究課題番号: 22J22904 (2022)
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 基金 (2023); 補助金 (2022)
• 応募区分: 国内
• 審査区分: 小区分49060:ウイルス学関連
• 研究機関: 東京理科大学
• 研究代表者: 塩野谷 果歩 東京理科大学, 創域理工学研究科, 特別研究員(DC1)
• 研究期間 (年度): 2023-03-08 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円); 2024年度: 800千円 (直接経費: 800千円); 2023年度: 800千円 (直接経費: 800千円); 2022年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
• キーワード: B型肝炎ウイルス / HBV / ウイルス侵入 / 受容体 / トロピズム / 宿主指向性 / 侵入 / ウイルス / EGFR / ユビキチン化

研究開始時の研究の概要

B型肝炎ウイルス(HBV)は標的細胞上のナトリウム-タウロコール酸共輸送体に吸着後、受容体チロシンキナーゼ(RTK)ファミリーの上皮成長因子受容体(EGFR)のエンドソーム輸送を介して内在化し、エンドソームへと輸送される。現在まで、EGFRが関わるHBV輸送に必要な因子やその制御メカニズム、RTK間での受容体共役因子能の共通性など、HBV侵入におけるRTKの役割の全貌は明らかになっていない。本研究ではHBV輸送に必要な因子や受容体共役因子能を有するRTKをHBV感染培養系を用いて同定し、得られた因子のHBV侵入における役割を解析することでHBV感染成立の分子機構の解明を目指す。

研究実績の概要

B型肝炎ウイルス(HBV)の宿主指向性の解明を目指し、HBV侵入受容体ナトリウム-タウロコール酸共輸送体(NTCP)ホモログによるHBV感染制限機序の解析を進めた。HBVの感染宿主域は狭く、ヒトやチンパンジーには感染するが、これらと系統的に最も近縁な旧世界ザルのcynomolgus macaqueはHBVに対して感受性を示さない。これは、HBV表層抗原の一部であるpreS1領域がmacaque由来のNTCP(mNTCP)に吸着できないためであるが、なぜmNTCPがHBV preS1吸着を許容できないのか、その制限メカニズムは理解されていない。本研究では、mNTCPによるHBV吸着および感染制限機序を解明することを目的とした。
クライオ電子顕微鏡解析によってmNTCP-胆汁酸複合体の立体構造を明らかにした(共同研究先)。mNTCP-胆汁酸複合体に、ヒトNTCP-preS1複合体構造のpreS1構造を仮想的に重ね合わせると、mNTCPのArg158がpreS1主鎖と立体障害を起こしていることが明らかとなった。mNTCP aa 158を19アミノ酸すべてに置換したmNTCP変異体を作出し、これらのpreS1吸着能を調べたところ、ヒト型のグリシンのみがpreS1吸着活性を示した。
mNTCPのaa 86およびaa 158をヒト型に置換した二重ヒト化変異は、aa 158単独ヒト化変異に比べ、preS1吸着およびHBV感染感受性を上昇させた。分子動力学シミュレーションによって、aa 86にヒト型のリジンを有することが、preS1の安定的な結合に寄与することが示された(共同研究先)。本研究において、NTCPの異なる２箇所における協調的なpreS1-NTCP結合様式が明らかとなり、mNTCPではこの2箇所における制限がHBV感染に対する分子バリアとなっていることが明らかとなった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

研究課題である「B型肝炎ウイルス(HBV)侵入過程における受容体共役因子の役割と制御機構に関する研究」は、HBV侵入における受容体型チロシンキナーゼ(RTK)の役割とその制御機序を解明することを目的としている。研究課題は、HBV吸着後過程に寄与するRTKに着目した解析を行うことで、HBV感染成立、宿主の感染感受性、HBVの細胞指向性決定原理を理解することを目指しているが、本年度行ったHBV侵入受容体ナトリウム-タウロコール酸共輸送体(NTCP)ホモログによるHBV感染制限機序の解析では、ウイルス吸着過程におけるHBV制限メカニズムを明らかにしており、こうした本年度の研究成果はHBVの細胞指向性・宿主指向性を理解するための重要な知見を提供するだけでなく、ウイルス吸着後過程におけるHBV感染制限に着目した研究課題の発展にも貢献すると考えているため、研究はおおむね順調に進展していると思われる。

今後の研究の推進方策

本年度までにAlphaScreen法でEGFR結合親和性が高かったEGFRユビキチン化酵素（E3リガーゼ）のうち、遺伝子ノックダウンによってHBV感染許容細胞でHBV感染を低下させた5つのE3リガーゼのEGFR結合能およびEGFRユビキチン化能を評価した。HBVエンベロープタンパク質の一部を模倣したペプチドプローブとHBV感染許容細胞株を用いた共焦点顕微鏡解析により、EGFR結合能およびEGFRユビキチン化能が確認できている候補E3リガーゼのHBVエンドソーム輸送の制御段階を評価したが、遺伝子ノックダウンでは表現系が見づらく、現在、これら候補E3リガーゼのノックアウト細胞の取得を試みている。ノックアウト細胞を使ってもなお候補E3リガーゼの細胞内HBV輸送への影響を評価しづらい場合は、本年度の研究成果を踏まえ、HBV吸着は成立するが感染は成立しない動物種(HBV吸着後過程がウイルス感染の制限となっている動物種)を同定し、それら動物種が有するHBV侵入受容体ホモログやRTKに着目することで、HBV感染成立、宿主の感染感受性、HBVの細胞指向性決定原理を理解することを目指す。

研究成果

• [雑誌論文] Identification of IMP Dehydrogenase as a Potential Target for Anti-Mpox Virus Agents (2023)
  • 著者名/発表者名: Hishiki T、Morita T、Akazawa D、Ohashi H、Park E、Kataoka M、Mifune J、Shionoya K、Tsuchimoto K、Ojima S、Azam Aa H、Nakajima S、Kawahara M、Yoshikawa T、Shimojima M、Kiga K、Maeda K、Suzuki T、Ebihara H、Takahashi Y、Watashi K.
  • 雑誌名: Microbiology Spectrum 巻: 11 号: 4
  • DOI: 10.1128/spectrum.00566-23
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] An ACAT inhibitor regulates SARS-CoV-2 replication and antiviral T cell activity (2023)
  • 著者名/発表者名: Nathalie M Schmidt, Rory Peters, Rachel Brown, Hao Wang, Leo Swadling, COVIDsortium Investigators, Joseph Newman, Nazia Thakur, Kaho Shionoya, Sophie B Morgan, Timothy SC Hinks, Koichi Watashi, Dalan Bailey, Scott B Hansen, Mala K Maini, Jane A McKeating
  • 雑誌名: PLoS Pathog 巻: 3 号: 5 ページ: e1011323-e1011323
  • DOI: 10.1371/journal.ppat.1011323
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Potential Anti-Mpox Virus Activity of Atovaquone, Mefloquine, and Molnupiravir, and Their Potential Use as Treatments (2023)
  • 著者名/発表者名: Akazawa D、Ohashi H、Hishiki T、Morita T、Iwanami S、Kim KS、Jeong YD、Park ES、Kataoka M、Shionoya K、Mifune J、Tsuchimoto K、Ojima S、Azam AH、Nakajima S、Park H、Yoshikawa T、Shimojima M、Kiga K、Iwami S、Maeda K、Suzuki T、Ebihara H、Takahashi Y、Watashi K
  • 雑誌名: The Journal of Infectious Diseases 巻: Online ahead of print. 号: 5 ページ: 591-603
  • DOI: 10.1093/infdis/jiad058
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Different efficacies of neutralizing antibodies and antiviral drugs on SARS-CoV-2 Omicron subvariants, BA.1 and BA.2 (2022)
  • 著者名/発表者名: Ohashi H、Hishiki T、Akazawa D、Kim KS、Woo J、Shionoya K、Tsuchimoto K、Iwanami S、Moriyama S、Kinoshita H、Yamada S、Kuroda Y、Yamamoto T、Kishida N、Watanabe S、Hasegawa H、Ebihara H、Suzuki T、Maeda K、Fukushi S、Takahashi Y、Iwami S、Watashi K
  • 雑誌名: Antiviral Research 巻: 205 ページ: 105372-105372
  • DOI: 10.1016/j.antiviral.2022.105372
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Analysis of the amino acid substitutions in NTCP determining the susceptibility to viral binding and its mechanisms (2023)
  • 著者名/発表者名: Kaho Shionoya, Junki Mifune, Atsuto Kusunoki, Chisa Kobayashi, Takeshi Morita, Kousho Wakae, Hideki Aizaki, Koichi Watashi
  • 学会等名: 2023 International HBV meeting
  • 国際学会
• [学会発表] B型肝炎ウイルス感染受容体NTCPのウイルス吸着および感染感受性における役割 (2023)
  • 著者名/発表者名: Kaho Shionoya, Junki Mifune, Atsuto Kusunoki, Chisa Kobayashi, Takeshi Morita, Kousho Wakae, Hideki Aizaki, Koichi Watashi
  • 学会等名: 第70回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] B型肝炎ウイルス感染における上皮増殖因子受容体の翻訳後修飾の役割 (2023)
  • 著者名/発表者名: Kaho Shionoya, Masashi Iwamoto, Kosho Wakae, Hideki Aizaki, Masamichi Muramatsu, Koichi Watashi
  • 学会等名: 第17回ウイルス学キャンプ 湯河原
• [学会発表] Role of post-translational modification of epidermal growth factor receptor in hepatitis B virus trafficking and infection (2023)
  • 著者名/発表者名: Kaho Shionoya, Masashi Iwamoto, Kosho Wakae, Hideki Aizaki, Masamichi Muramatsu, Koichi Watashi
  • 学会等名: The 9th Japan-Taiwan-Korea HBV Research Symposium
  • 国際学会
• [学会発表] Role of post-translational modification of epidermal growth factor receptor in hepatitis B virus trafficking and infection (2022)
  • 著者名/発表者名: Kaho Shionoya, Masashi Iwamoto, Kosho Wakae, Hideki Aizaki, Masamichi Muramatsu, Koichi Watashi
  • 学会等名: 第69回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] Role of post-translational modification of epidermal growth factor receptor in hepatitis B virus trafficking and infection (2022)
  • 著者名/発表者名: Kaho Shionoya, Masashi Iwamoto, Kosho Wakae, Hideki Aizaki, Masamichi Muramatsu, Koichi Watashi
  • 学会等名: 2022 International HBV Meeting
  • 国際学会
• [図書] 医学のあゆみ Vol.281 No.3（HBV培養細胞系を利用したウイルス侵入メカニズムの解析と創薬研究の進展） (2022)
  • 著者名/発表者名: 塩野谷果歩、渡士幸一
  • 総ページ数: 295
  • 出版者: 医歯薬出版