外向き型及び内向き型バンド３／抗体複合体の三次元結晶構造解析

• 研究課題/領域番号: 23370049
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 構造生物化学
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 小林 拓也 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20311730)
• 研究分担者: 濱崎 直孝 長崎国際大学, 薬学部, 名誉教授 (00091265)
• 研究期間 (年度): 2011-04-01 – 2014-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2013年度)
• 配分額: 19,240千円 (直接経費: 14,800千円、間接経費: 4,440千円); 2013年度: 5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円); 2012年度: 5,980千円 (直接経費: 4,600千円、間接経費: 1,380千円); 2011年度: 7,800千円 (直接経費: 6,000千円、間接経費: 1,800千円)
• キーワード: X線結晶構造解析 / アニオントランスポーター / バンド3 / 赤血球 / 抗体 / 結晶構造解析

研究概要

2008～2010年の基盤研究（B）では、バンド3に対する構造認識抗体を作製し、アニオン輸送の阻害剤を噛ませて外向き型に固定化したバンド3／抗体（Fab）複合体を結晶化し、分解能3.4Åの電子密度図に対しモデル構築と精密化を進めた。2011～2013年の基盤研究（B）では前回のモデルでは見えなかった部位の構造を明らかにするため、外向き型バンド3／Fab複合体の結晶化条件の最適化、抗体分子を使わないバンド3単独による結晶化の検討、さらに内向き型バンド3の結晶化及び構造解析を目指した。これまでの蒸気拡散法だけでなく、脂質キュービックフェーズ法など異なる結晶化方法を検討した。

研究成果

• [雑誌論文] GPCRの立体構造から解き明かす生命科学 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也、岩田想
  • 雑誌名: 実験医学増刊 羊土社 巻: Vol. 32, No. 10 ページ: 84-91
• [雑誌論文] Synthesis of photoreactive 2-phenethylamine derivatives Synthesis of adenosine derivative enabling functional analysis of adenosine receptors by photoaffinity labeling (2013)
  • 著者名/発表者名: Murai, Y., Masuda, K., Ogasawara, Y., Wang, L., Hashidoko, Y., Hatanaka, Y., Iwata, S., Kobayashi, T., and Hashimoto, M
  • 雑誌名: Eur. J. Org. Chem 巻: 2013 ページ: 2428-2433
  • NAID: 120005981508
• [雑誌論文] Synthesis of photoreactive 2-phenethylamine derivatives - Synthesis of adenosine derivative enabling functional analysis of adenosine receptors by photoaffinity labeling. (2013)
  • 著者名/発表者名: Murai Y. et al.
  • 雑誌名: Eur. J. Org. Chem. 巻: 2013 ページ: 2428-2433
  • 査読あり
• [雑誌論文] G蛋白質共役受容体のX線結晶構造解析の進歩 (2013)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 雑誌名: 血栓と循環 メディカルレビュー社 巻: Vol. 21, No. 3 ページ: 33-40
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist (2012)
  • 著者名/発表者名: Haga, K., Kruse, A.C., Asada, H., Yurugi-Kobayashi, T., Shiroishi, M., Zhang, C., Weis, W.I., Okada, T., Kobilka, B.K., Haga, T. and Kobayashi, T
  • 雑誌名: Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist 巻: 482 ページ: 547-551
  • NAID: 120003752107
• [雑誌論文] Platform for the rapid construction and evaluation of GPCRs for crystallography in Saccharomyces cerevisiae (2012)
  • 著者名/発表者名: Shiroishi, M., Tsujimoto, H., Makyio, H., Asada, H., Yurugi-Kobayashi, T., Shimamura, T., Nomura, N., Haga, T., Iwata, S. and *Kobayashi, T
  • 雑誌名: Microb. Cell Fact 巻: 11 ページ: 78-78
• [雑誌論文] Production of the stable human histamine H1 receptor in Pichia pastoris for structural determination (2012)
  • 著者名/発表者名: Shiroishi, M., Kobayashi, T., Ogasawara, S., Tsujimoto, H., Ikeda-Suno, C., Iwata, S. and Shimamura, T
  • 雑誌名: Methods 巻: 55 ページ: 281-286
• [雑誌論文] protein-coupled receptor inactivation by an allosteric inverse-agonist antibody (2012)
  • 著者名/発表者名: Hino, T., Arakawa, T., Iwanari, H., Yurugi-Kobayashi, T., Ikeda-Suno, C., Nakada-Nakura, Y., Kusano-Arai, O., Weyand, S., Shimamura, T., Nomura, N., Cameron, A.D., Kobayashi, T., Hamakubo, T., Iwata, S. and Murata, T. G
  • 雑誌名: Nature 巻: 482 ページ: 237-240
• [雑誌論文] Platform for the rapid construction and evaluation of GPCRs for crystallography in Saccharoroyces cerevisiae. (2012)
  • 著者名/発表者名: Shiroishi M., et al.
  • 雑誌名: Micorb, Cell Fact. 巻: 11 号: 1 ページ: 78-78
  • DOI: 10.1186/1475-2859-11-78
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist (2012)
  • 著者名/発表者名: Haga K., et al
  • 雑誌名: Nature 巻: 482 号: 7386 ページ: 547-551
  • DOI: 10.1038/nature10753
  • 査読あり
• [雑誌論文] G protein-coupled receptor inactivation by an allosteric inverse-agonist antibody (2012)
  • 著者名/発表者名: Hino T., et al
  • 雑誌名: Nature 巻: 482 号: 7384 ページ: 237-40
  • DOI: 10.1038/nature10750
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure of the human histamine H1 receptor complex with doxepin (2011)
  • 著者名/発表者名: Shimamura, T., Shiroishi, M., Weyand, S., Tsujimoto, H., Winter, G., Katritch, V., Abagyan, R., Cherezov, V., Liu, W., Han, G.W., Kobayashi, T., Stevens, R.C. and Iwata, S
  • 雑誌名: Nature 巻: 475 ページ: 65-70
  • NAID: 120004225543
• [雑誌論文] Cloning, expression and purification of the anion exchanger 1 homologue from basidiomycete Phanerochaete chrysosporium (2011)
  • 著者名/発表者名: Tokuda, N., Igarashi, K., Shimamura, T., Yurugi-Kobayashi, T., Shiroishi, M., Ito, K., Sugawara, T., Asada, H., Murata, T., Nomura, N., Iwata, S. and Kobayashi, T
  • 雑誌名: Protein Expr. Purif 巻: 79 ページ: 81-87
  • NAID: 120003255719
• [雑誌論文] Evaluation of the Pichia pastoris expression system for the production of GPCRs for structural analysis (2011)
  • 著者名/発表者名: Asada, H., Uemura, T., Yurugi-Kobayashi, T., Shiroishi, M., Shimamura, T., Tsujimoto, H., Ito, K., Sugawara, T., Nakane, T., Nomura, N., Murata, T., Haga, T., Iwata, S. and Kobayashi, T
  • 雑誌名: Microb. Cell Fact 巻: 10 ページ: 24-24
• [雑誌論文] Cysteine-to-serine shuffling using a yeast expression system improves protein secretion : case of a nonglycosylated mutant of miracullin, a taste-modifying protein (2011)
  • 著者名/発表者名: Ito, K., Sugawara, T., Koizumi, A., Nakajima, K., Shimizu-Ibuka, A., Shiroishi, M., Asada, H., Yurugi-Kobayashi, T., Shimamura, T., Asada, T., Misaka, T., Iwata, S., Kobayashi, T. and Abe, K
  • 雑誌名: Biotech. Lett 巻: 33 ページ: 103-107
• [雑誌論文] Crystal structure of Glucansucrase from the dental caries pathogen Streptococcus mutans (2011)
  • 著者名/発表者名: Ito, K., Ito, S., Shimamura, T., Weyand, S., Kawarasaki, Y., Misaka, T., Abe, K., Kobayashi, T., Cameron, A.D., and Iwata S
  • 雑誌名: J. Molecular Biology 巻: 408 ページ: 177-186
• [学会発表] Towards structure based GPCR pharmacology (2012)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: Gordon Research Conference
  • 発表場所: 米国
• [学会発表] Crystallization of human membrane proteins using antibody fragments
  • 著者名/発表者名: Kobayashi, T
  • 学会等名: Protein Island Matsuyama (PIM) International Symposium 2013
  • 発表場所: Matsuyama
  • 招待講演
• [学会発表] Crystallization of mammalian membrane proteins using antibody fragments
  • 著者名/発表者名: Kobayashi, T
  • 学会等名: 4th International Symposium on Diffraction Structural Biology
  • 発表場所: Nagoya
  • 招待講演
• [学会発表] Towards Structure Based GPCRs Pharmacology; From Knockout Mice to Crystal Structures
  • 著者名/発表者名: Kobayashi, T.
  • 学会等名: Gordon Research Conference
  • 発表場所: Venture, CA, USA
  • 招待講演
• [学会発表] 機能性抗体を利用したGPCRのX線結晶構造解析への試み(シンポジウム)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: 千里ライフサイエンスセミナー
  • 発表場所: 大阪
• [学会発表] 「GPCRの構造解析」から創薬は可能か?
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: 持田製薬株式会社
  • 発表場所: 静岡
• [学会発表] GPCRのシグナル伝達分子機構の解明から創薬に向けて(シンポジウム)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: 第86回日本生化学会大会
  • 発表場所: 横浜
• [学会発表] GPCRのX線結晶構造解析と創薬に必要なGPCRの構造情報について(シンポジウム)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: よこはまNMR構造生物学研究会第47回ワークショップ
  • 発表場所: 横浜
• [学会発表] GPCRをターゲットにしたX線結晶構造解析の現状と今後の展望(シンポジウム)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: 2012年日本神経化学会公開シンポジウム
  • 発表場所: 神戸
• [学会発表] GPCRをターゲットにした「構造に指南された創薬」を目指すための三つの戦略
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: 構造活性フォーラム2012
  • 発表場所: 京都
• [学会発表] G蛋白共役受容体(GPCR)のX線結晶構造解析を成功させるための戦略(シンポジウム)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: 第85回日本薬理学会年会
  • 発表場所: 京都
• [学会発表] ムスカリン性アセチルコリン受容体M2サブタイプの三次元結晶構造解析に向けた試み(シンポジウム)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: 第84回日本生化学会大会
  • 発表場所: 京都
• [学会発表] Molecular Basis of Antihistamine Specificity Against Human Histamine H1 Receptor(シンポジウム)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: 第84回日本生化学会大会
  • 発表場所: 京都
• [学会発表] G 蛋白共役受容体(GPCR)の結晶構造解析に向けた試み(シンポジウム)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: 第84回日本薬理学会年会
  • 発表場所: 横浜
• [学会発表] Crystallization of human membrane proteins using antibody fragments.
  • 著者名/発表者名: Kobayashi T.
  • 学会等名: Protein Island Matsuyama (PIM) International Symposium 2013
  • 発表場所: Matsuyama
  • 招待講演
• [学会発表] Crystallization of mammalian membrane proteins using antibody fragments.
  • 著者名/発表者名: Kobayashi T.
  • 学会等名: 4th International Symposium on Diffraction Structural Biology
  • 発表場所: Nagoya
  • 招待講演
• [学会発表] 機能性抗体を利用したGPCRのX線結晶構造解析への試み
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: 千里ライフサイエンスセミナー
  • 発表場所: 大阪市
  • 招待講演
• [学会発表] GPCRのシグナル伝達分子機構の解明から創薬に向けて
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: 第86回日本生化学会大会
  • 発表場所: 横浜市
  • 招待講演
• [学会発表] GPCRのX線結晶構造解析と創薬に必要なGPCRの構造情報について
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: よこはまNMR構造生物学研究会 第47回ワークショップ
  • 発表場所: 横浜市
  • 招待講演
• [学会発表] GPCRをターゲットにした『構造に指南された創薬』を目指すための三つの戦略
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: 構造活性フォーラム2012
  • 発表場所: 京都市
  • 招待講演
• [学会発表] GPCRをターゲットにしたX線結晶構造解析の現状と今後の展望
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: 日本神経化学会公開シンポジウム
  • 発表場所: 神戸市
  • 招待講演
• [学会発表] GPCRの構造解析と抗体の利用
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: 千里ライフサイエンスセミナー
  • 発表場所: 大阪市
• [図書] GPCRの立体構造から解き明かす生命科学 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也, 岩田想
  • 出版者: 羊土社
• [図書] G蛋白質共役受容体のX線結晶構造解析の進歩, 血栓と循環 (2013)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 出版者: メディカルレビュー社
• [図書] 「膜タンパク質」の重要性とその構造が拓く未来, 膜タンパク質構造研究最前線 (2013)
  • 著者名/発表者名: 村田武士, 小林拓也, 野村紀通, 岩田想
  • 出版者: 化学同人
• [図書] ムスカリン性アセチルコリン受容体の構造解析から創薬に向けて, 膜タンパク質構造研究最前線 (2013)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 出版者: 化学同人
• [図書] 「膜タンパク質」の重要性とその構造が拓く未来 膜タンパク質構造研究 最前線 (2013)
  • 著者名/発表者名: 村田武士、小林拓也、野村紀通、岩田想
  • 出版者: 化学同人
• [図書] ムスカリン性アセチルコリン受容体の構造解析から創薬に向けて 膜タンパク質構造研究 最前線 (2013)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 出版者: 化学同人
• [図書] 膜タンパク質の発現と精製 「昆虫細胞による生産」 膜タンパク質構造研究 最前線 (2013)
  • 著者名/発表者名: 浅田秀基、小林拓也
  • 出版者: 化学同人
• [図書] GPCRのX線結晶構造解析に成功するための技術的進展, 実験医学 (2012)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也, 岩田想
  • 出版者: 羊土社
• [図書] ムスカリン受容体の立体構造が明らかに, 医学のあゆみ (2012)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 出版者: 医歯薬出版
• [図書] Gタンパク共役受容体(GPCR)の三次元結晶構造解析への試み, バイオインダストリー (2011)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 出版者: シーエムシー出版
• [備考]
  • URL: http://cell.mfour.med.kyoto-u.ac.jp/
• [備考] http://cell.mfour.med.kyoto-u.ac.jp/
• [産業財産権] アゴニストの親和性を亢進する抗ヒトアデノシンA2a受容体モノクローナル抗体 (2012)
  • 発明者名: 小笠原諭, 日野智也, 島村達郎 , 荒川孝俊, 万木貴美, 寿野千代, 村田武士, 小林拓也, 岩田想
  • 権利者名: 独立行政法人科学技術振興機構
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2012-03-06
• [産業財産権] 抗ヒトバンド3モノクローナル抗体 (2011)
  • 発明者名: 小林拓也, 小林貴美, 荒川孝俊, 日野智也, 村田武士, 野村紀通, 岩田想, 浜窪隆雄, 岩成宏子, 望月康弘, 濱崎直孝
  • 権利者名: 独立行政法人科学技術振興機構
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2011-11-10