伸長胚選別によるウシＥＳ細胞キメラ作出の効率化

• 研究課題/領域番号: 23380169
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 統合動物科学
• 研究機関: 独立行政法人農業生物資源研究所
• 研究代表者: 古澤 軌 独立行政法人農業生物資源研究所, その他部局等, 研究員 (00343997)
• 研究分担者: 木村 康二 岡山大学, 環境生命科学科, 准教授 (50355070) ; 松山 秀一 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 家畜繁殖研究グループ, 主任研究員 (50455317)
• 研究期間 (年度): 2011-04-01 – 2016-03-31
• 研究課題ステータス: 採択後辞退 (2015年度)
• 配分額: 18,070千円 (直接経費: 13,900千円、間接経費: 4,170千円); 2015年度: 3,120千円 (直接経費: 2,400千円、間接経費: 720千円); 2014年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円); 2013年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円); 2012年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円); 2011年度: 6,370千円 (直接経費: 4,900千円、間接経費: 1,470千円)
• キーワード: ウシES細胞 / 伸長胚 / ゲノム編集 / ゲノム改変

研究実績の概要

[ウシES細胞の高品質化]
幹細胞マーカーであるPOU5F1の発現量をTet-onシステムで調節可能なウシES細胞株を樹立した。
①キメラ形成能を調べるため、DiIで蛍光標識したES細胞を5個注入した8-16細胞期のマウスあるいはウシ胚をドキシサイクリン（Dox）存在（1μg/ml）、非存在下で培養し、胚盤胞期胚における局在を調べた。8細胞期のマウス胚をホストとした場合、3株中2株において、Dox 存在下の方がICM（inner cell mass）に局在する割合が1.8-3.2倍有意に高かった。Doxの添加時間を0、12、24、及び48時間に設定して局在を比較したところ、24時間ではICMへの局在が2倍以上に増加するものの、それ以上の添加は効果が認められなかった。8-16細胞期のウシ胚をホストにした場合もDox添加24時間でICMへの局在及び取り込みがそれぞれ2倍以上に増加したが、48時間以上の添加は胚発生に悪影響が認められた。TE（trophectoderm）への局在も増加したことから、Dox添加によるPOU5F1の上昇は細胞の未分化性よりも生存性の維持に影響を与え、寄与率が増加したと考えられた。
②ウシES細胞とマウスES細胞を2日間単独、あるいは混合培養したマトリゲルビーズをDoxを徐放的に放出する浸透圧ポンプとともにヌードマウスに移植し、3週間後に腫瘍を回収して、蛍光観察及び免疫組織学的解析によりテラトーマ形成能を調べた。ウシES細胞のビーズを単独、あるいはマウスES細胞と隣接して移植した場合、ウシES細胞由来の奇形腫形成が認められたものの、特定の細胞系譜へ分化した像は観察できなかった。一方、両者を混合培養したビーズを移植したところ、マウスES細胞由来のテラトーマ中にウシES細胞由来の上皮、神経叢、血管内皮、及び腺組織が認められたことから、分化誘導をサポートする組織が存在することにより三胚葉に分化し得ることが確認された。

現在までの達成度 (段落)

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。

今後の研究の推進方策

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Successful Nonsurgical Transfer of Bovine Elongating Conceptuses and Its Application to Sexing (2014)
  • 著者名/発表者名: Koji Kimura and Shuichi Matsuyama
  • 雑誌名: Journal of Reproduction and Development 巻: 60 号: 3 ページ: 210-215
  • DOI: 10.1262/jrd.2013-137
  • NAID: 130003390835
  • ISSN: 0916-8818, 1348-4400
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Characteristics of bovine inner cell mass-derived cell lines and their fate in chimeric conceptuses (2013)
  • 著者名/発表者名: Furusawa T, Ohkoshi K, Kimura K, Matsuyama S, Akagi S, Kaneda M, Ikeda M, Hosoe M, Kizaki K, Tokunaga T
  • 雑誌名: Biology of Reproduction 巻: 89（2）：28 号: 2 ページ: 1-12
  • DOI: 10.1095/biolreprod.112.106641
  • 査読あり
• [学会発表] ウシDDX4プロモーター制御下でDsRedを発現するトランスジェニックマウスの解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 1)古澤軌, 大越勝広, 細江実佐, 池田光美, 赤木悟史, 木村康二, 松山秀一, 徳永智之
  • 学会等名: 第107回日本繁殖生物学会
  • 発表場所: 帯広畜産大学
  • 年月日: 2014-08-21 – 2014-08-24
• [学会発表] POU5F1発現誘導システムによる高品質ウシES細胞樹立の試み (2014)
  • 著者名/発表者名: 2)池田光美, 古澤軌, 大越勝広, 細江実佐, 木村康二, 松山秀一, 赤木悟史, 徳永智之
  • 学会等名: 第107回日本繁殖生物学会
  • 発表場所: 帯広畜産大学
  • 年月日: 2014-08-21 – 2014-08-24
• [学会発表] 伸長胚移植によるウシES様細胞の多能性解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 池田光美, 古澤軌, 大越勝広, 細江実佐, 木村康二, 松山秀一, 赤木悟史, 金田正弘, 木崎景一郎, 徳永智之
  • 学会等名: 第106回日本繁殖生物学会大会
  • 発表場所: 東京農工大学農学部府中キャンパス
• [学会発表] A feature of self-renewal porcine embryonic stem cell-like cell lines established by inhibitors (2013)
  • 著者名/発表者名: Haraguchi S
  • 学会等名: Reproduction, Fertility and Development
  • 発表場所: ドイツ
• [学会発表] ウシ胚性幹細胞の利用技術の開発 (2013)
  • 著者名/発表者名: 古澤軌
  • 学会等名: NIAS/NILGS合同シンポジウム
  • 発表場所: つくば市
  • 招待講演
• [学会発表] Heterogeneity of embryonic stem cells and its application to generation of transgenic animals (2012)
  • 著者名/発表者名: Furusawa T
  • 学会等名: 第105回日本繁殖生物学会 日-チェコ交流シンポジウム
  • 発表場所: 東京
  • 招待講演
• [学会発表] 第2卵割抑制によるウシ体外受精由来4倍体胚の作製と体外発生能の検討 (2012)
  • 著者名/発表者名: 大越勝広
  • 学会等名: 第105回日本繁殖生物学会
  • 発表場所: つくば市
• [学会発表] ウシ胚由来多能性幹細胞に関する研究の状況 (2012)
  • 著者名/発表者名: 徳永智之
  • 学会等名: 第53回日本哺乳動物卵子学会
  • 発表場所: 千里ライフサイエンスセンター
  • 招待講演
• [学会発表] IVF胚及びSCNT胚由来ウシES細胞の遺伝子発現及びメチル化パターンの差違 (2011)
  • 著者名/発表者名: 古澤軌, 池田光美, 細江実佐, 金田正弘, 赤木悟史, 大越勝広, 木崎景一郎, 徳永智之
  • 学会等名: 第104回日本繁殖生物学会
  • 発表場所: いわて県民情報交流センター・アイーナ
  • 年月日: 2011-09-16
• [学会発表] IVF胚及びSCNT胚由来ウシES細胞核移植胚の発生能とメチル化状態の差違 (2011)
  • 著者名/発表者名: 池田光美, 水谷英二, 金田正弘, 赤木悟史, 細江美佐, 大越勝広, 古津軌, 野口龍生, 徳永智之
  • 学会等名: 第104回日本繁殖生物学会
  • 発表場所: いわて県民情報交流センター・アイーナ
  • 年月日: 2011-09-15
• [備考] 生物研ニュース47
  • URL: http://www.nias.affrc.go.jp/newsletter/news/2013/News47_html/kaigi1.html