ラパマイシンで惹起されない新しいオートファジー機構を用いた新規薬剤スクリーニング

• 研究課題/領域番号: 23659036
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 配分区分: 基金
• 研究分野: 生物系薬学
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 小堤 保則 京都大学, 大学院・生命科学研究科, 教授 (70205425)
• 研究分担者: 山銅 ゆかり 京都大学, 大学院・生命科学研究科, 教務職員 (70359785)
• 研究期間 (年度): 2011
• 研究課題ステータス: 完了 (2011年度)
• 配分額: 3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円); 2011年度: 3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)
• キーワード: オートファジー / ラパマイシン / 酵母 / Ypk1 / スクリーニング / セリン・スレオニンキナーゼ

研究概要

申請者らは、窒素源飢餓によるオートファジー誘導系に、ラパマイシンで惹起される経路の他に、惹起されない経路があることを見いだしたさらに、後者の経路もラパマイシンで惹起される経路と同程度に飢餓応答に必要な経路であることを明らかにした。ラパマイシンが免疫抑制剤、抗ガン剤さらには寿命を延ばす薬剤としても注目を集めていることから、本研究では、後者のオートファジーを惹起する物質も同様に有用なものであると考え、この物質を、新しいオートファジー機構を利用してスクリーニングする系の開発を行うために、以下の2点について研究した。
薬剤スクリーニング系の確立を目指した研究ラパマイシンで模倣できない新しいオートファジー経路で分解されるタンパク質として酵母の細胞質にあるYpk1に注目し、蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現させ顕微鏡で観察できる系を確立した。主要な液胞(哺乳動物のリソソーム)のタンパク分解酵素を欠損させた細胞を使うことにより、薬剤添加時に、このオートファジー経路が活性化されれば、融合タンパク質が細胞質から液胞に運ばれるため、細胞質の蛍光強度が減少し、液胞の蛍光強度がすることが判定できる。また、適当なYpk1の断片を使うことにより、より一層観察しやすい系を確立した。また、簡便な系としては野生株を用いてSDS-PAGE後に、western blotを行い、分解の有無で判断するシステムを確立した。
セリン/スレオニンキナーゼ欠損株のスクリーニングラパマイシンで惹起されない経路に於ける、Ypk1の上流のキナーゼがTORC1と同様、セリン/スレオニンキナーゼであると仮定して、セリン/スレオニンキナーゼ欠損株のスクリーニングを行った。その結果、ある種のセリン/スレオニンキナーゼがin vivoあるいはin vitroにおいてもYpk1をリン酸化することを見出した。

研究成果

• [雑誌論文] Tedder TFCD22 serves as a receptor for soluble IgM (2012)
  • 著者名/発表者名: Adachi T, Harumiya S, Takematsu H, Kozutsumi Y, Wabl M, Fujimoto M
  • 雑誌名: Eur J Immunol 巻: 42(1) ページ: 241-247
  • 査読あり
• [雑誌論文] CD22 serves as a receptor for soluble IgM (2012)
  • 著者名/発表者名: Adachi T, Harumiya S, Takematsu H, Kozutsumi Y, Wabl M, Fujimoto M, Tedder TF
  • 雑誌名: Eur J Immunol 巻: 42(1) 号: 1 ページ: 241-247
  • DOI: 10.1002/eji.201141899
  • 査読あり
• [雑誌論文] Induction of feline immunodeficiency virus from a chronically infected feline T-lymphocyte cell line (2012)
  • 著者名/発表者名: Tochikura TS, Naito Y, Kozutsumi Y, Hohdatsu T
  • 雑誌名: Res Vet Sci 巻: 92(2) 号: 2 ページ: 327-32
  • DOI: 10.1016/j.rvsc.2011.02.013
  • 査読あり
• [雑誌論文] Quantitative transcriptomic profiling of branching in a glycosphingolipid biosynthetic pathway (2011)
  • 著者名/発表者名: Takematsu H, Yamamoto H, Naito-Matsui Y, Fujinawa R, Tanaka K, Okuno Y, Tanaka Y, Kyogashima M, Kannagi R, Kozutsumi Y
  • 雑誌名: Biol Chem 巻: 286(31) ページ: 27214-27224
• [雑誌論文] CD22-Antagonists with nanomolar potency : The synergistic effect of hydrophobic groups at C-2 and C-9 of sialic acid scaffold (2011)
  • 著者名/発表者名: Abdu-Allah HHM, Watanabe K, Completo GC, Sadagopan M, Hayashizaki K, Takaku C, Tamanaka T, Takematsu H, Kozutsumi Y, Paulson JC, Tsubata T, Ando H, Ishida H, Kiso M
  • 雑誌名: Bioorg and Med Chem 巻: 19(6) ページ: 1966-71
• [雑誌論文] Sphingosylphosphorylcholine and lysosulfatide have inverse regulatory function in monocytic cell differentiation into macrophages (2011)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto H, Naito Y, Okano M, Kanazawa T, Takematsu H, Kozutsumi Y
  • 雑誌名: Arch Biochem Biophys 巻: 506(1) ページ: 83-91
  • NAID: 120002770476
• [雑誌論文] Quantitative transcriptomic profiling of branching in a glycosphingolipid biosynthetic pathway (2011)
  • 著者名/発表者名: Takematsu H, Yamamoto H, Naito-Matsui Y, Fujinawa R, Tanaka K, Okuno Y, Tanaka Y, Kyogashima M, Kannagi R, Kozutsumi Y
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 286(31) ページ: 27214-27224
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of Ypk1 as a novel selective substrate for nitrogen starvation-triggered proteolysis requiring autophagy system and ESCRT machinery components (2010)
  • 著者名/発表者名: Shimobayashi M, Takematsu H, Eiho K, Yamane Y, Kozutsumi Y
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 285(47) ページ: 36984-94
• [学会発表] Regulatory Functions of Activation-Dependent Reduction of N-glycolylneuraminic Acid in Mouse T Cells2011 Annual Conference of the Society for Glycobiology (2011)
  • 著者名/発表者名: Y. Naito-Matsui, H. Takematsu, K. Murata, Y. Kozutsumi
  • 発表場所: シアトル(アメリカ)
  • 年月日: 2011-11-10
• [学会発表] Involvement of sphingolipids in phosphorylation and degradation of Ypk1 in the stress response of Yeast (2011)
  • 著者名/発表者名: Y.Kozutsumi M.Tomioka, M.Shimobayashi, Y.Yamane, H.Takematsu
  • 学会等名: The 31st NAITO conference on Glycan empression and regulation [II]
  • 発表場所: Sapporo(招待溝演)
  • 年月日: 2011-09-14
• [学会発表] スフィンゴ脂質とESCRT複合体が関与するYpk1の窒素源飢餓による分解 (2011)
  • 著者名/発表者名: 下林貢、富岡真、山根ゆかり、竹松弘、小堤保則
  • 学会等名: 第53回日本脂質生化学会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2011-05-13
• [学会発表] Involvement of sphingolipids in phosphorylation and degradation of Ypk1 in the stress response of Yeast (2011)
  • 著者名/発表者名: Y. Kozutsumi, M. Tomioka, M. Shimobayashi, Y. Yamane, H. Takematsu
  • 学会等名: The 31st NAITO conference on Glycan expression and regulation[II]
  • 発表場所: Sapporo, Japan
• [図書] スフィンゴ脂質が関わる免疫抑制とシグナル伝達化学と生物 (2011)
  • 著者名/発表者名: 竹松弘, 小堤保則
  • 総ページ数: 49
  • 出版者: 日本農芸化学会
• [図書] スフィンゴ脂質が関わる免疫抑制とシグナル伝達(化学と生物49(05)) (2011)
  • 著者名/発表者名: 竹松弘, 小堤保則
  • 出版者: 日本農芸化学会