新規高精度赤外分光光度計の開発とそれを用いた巨大膜蛋白質のプロトンポンプ反応追跡

• 研究課題/領域番号: 23685040
• 研究種目: 若手研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 生体関連化学
• 研究機関: 独立行政法人理化学研究所 (2012-2013); 兵庫県立大学 (2011)
• 研究代表者: 久保 稔 独立行政法人理化学研究所, 放射光科学総合研究センター, 研究員 (90392878)
• 研究期間 (年度): 2011-04-01 – 2014-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2013年度)
• 配分額: 20,150千円 (直接経費: 15,500千円、間接経費: 4,650千円); 2013年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円); 2012年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円); 2011年度: 16,120千円 (直接経費: 12,400千円、間接経費: 3,720千円)
• キーワード: 赤外分光法 / 時間分解振動分光法 / ヘムタンパク質 / 膜タンパク質 / チトクロム酸化酵素 / プロトンポンプ / 一酸化窒素還元酵素 / フェムト秒レーザー / 時間分解赤外分光 / 酵素反応 / 光反応

研究概要

タンパク質の反応を生理条件下で実時間観測できる赤外分光装置を開発し、それを巨大膜タンパク質に応用することを目的とした。光源にフェムト秒赤外レーザーを用いて高感度の赤外分光装置を製作する一方、ケージド化合物を用いて反応を制御するフロー・フラッシュ計測系を開発した。マイクロ流路フローセルを使用し、試料消費を抑えたフロー計測系を実現した。フロー・フラッシュ計測系を時間分解可視分光装置に組み込み、NO還元酵素に応用した結果、この膜タンパク質の酵素反応をマイクロ秒の時間分解能で観測することに成功した。現在、フロー・フラッシュ計測系を時間分解赤外分光装置に組み込み、酵素反応の赤外分光観測を進めている。

研究成果

• [雑誌論文] Effective Pumping Proton Collection Facilitated by a Copper Site (CuB) of Bovine Heart Cytochrome c Oxidase, Revealed by a Newly Developed Time-resolved Infrared System (2013)
  • 著者名/発表者名: Minoru Kubo, Satoru Nakashima, Satoru Yamaguchi, Takashi Ogura, Masao Mochizuki, Jiyoung Kang, Masaru Tateno, Kyoko Shinzawa-Itoh, Koji Kato and Shinya Yoshikawa
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 288 号: 42 ページ: 30259-30269
  • DOI: 10.1074/jbc.m113.473983
  • 査読あり
• [雑誌論文] Redox Properties of Mononuclear Copper(II)-Superoxide Complex (2013)
  • 著者名/発表者名: Shinobu Itoh
  • 雑誌名: Inorg. Chem. 巻: 52 号: 18 ページ: 10431-10437
  • DOI: 10.1021/ic401261z
  • 査読あり
• [雑誌論文] Oxo-sulfido- and oxo-selenido-molybdenum(VI) complexes possessing dithiolene ligand related to the active sites of hydroxylases of molybdoenzymes: Low temperature preparation and characterisation (2013)
  • 著者名/発表者名: Shinobu Itoh, et al.
  • 雑誌名: Chem. Commun. 巻: 49 号: 39 ページ: 4358-4360
  • DOI: 10.1039/c2cc35345h
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A new series of bis(ene-1,2-dithiolato)tungsten(IV), -(V), -(VI) complexes as reaction centre models of tungsten enzymes: preparation, crystal structures and spectroscopic properties (2013)
  • 著者名/発表者名: Shinobu Itoh, et al.
  • 雑誌名: Dalton Trans. 巻: 42 号: 9 ページ: 3059-3070
  • DOI: 10.1039/c2dt32179c
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Copper(I)-dioxygen reactivity in a sterically demanding tripodal tetradentate tren ligand. Formation and reactivity of a mononuclear copper(II) end-on superoxo complex (2012)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi, Y., Okubo, K., Nomura, T., Kubo, M., Fujieda, N., Sugimoto, H., Fukuzumi, S., Goto, K., Ogura, T., Itoh, S
  • 雑誌名: Eur. J. Inorg. Chem 巻: (29) (Selected for Cover Picture) 号: 29 ページ: 4574-4578
  • DOI: 10.1002/ejic.201290089
  • 査読あり
• [雑誌論文] Chromium(IV)-peroxo complex formation and its nitric oxide dioxygenase reactivity (2012)
  • 著者名/発表者名: Yokoyama, A., Han, J. E., Cho, J., Kubo, M., Ogura, T., Siegler, M. A., Karlin, K. D., Nam, W
  • 雑誌名: J. Am. Chem. Soc 巻: Vol. 134 号: 37 ページ: 15269-15272
  • DOI: 10.1021/ja307384e
  • 査読あり
• [雑誌論文] DFT Analysis of Low-frequency Heme Vibrations in Soluble Guanylate Cyclase: Raman Mode Enhancement by Propionate-Protein Interactions (2012)
  • 著者名/発表者名: M. Kubo
  • 雑誌名: Chemistry Letters 巻: 41 号: 9 ページ: 860-862
  • DOI: 10.1246/cl.2012.860
  • NAID: 10031030516
  • 査読あり
• [雑誌論文] Site-specific protein dynamics in communication pathway from sensor to signaling domain of oxygen sensor protein, HemAT-Bs : time-resolved ultraviolet resonance Raman study (2012)
  • 著者名/発表者名: S. El-Mashtoly, M. Kubo, Y. Gu, H. Sawai, S. Nakashima, T. Ogura, S. Aono, T. Kitagawa
  • 雑誌名: J. Biol. Chem 巻: 287 号: 24 ページ: 19973-19984
  • DOI: 10.1074/jbc.m112.357855
  • 査読あり
• [雑誌論文] Copper(I)-Dioxygen Reactivity in a Sterically Demanding Tripodal Tetradentate tren Ligand. Formation and Reactivity of a Mononuclear Copper(II) End-on Superoxo Complex (2012)
  • 著者名/発表者名: Shinobu Itoh, et al.
  • 雑誌名: Eur. J. Inorg. Chem. 巻: 2012 号: 29 ページ: 4574-4578
  • DOI: 10.1002/ejic.201200177
  • 査読あり
• [雑誌論文] Chromium(V)-oxo and chromium(III)-superoxo complexes bearing a macrocyclic TMC ligand in hydrogen atom abstraction reactions (2011)
  • 著者名/発表者名: Cho, J., Woo, J., Han, J. E., Kubo, M., Ogura, T., Nam, W
  • 雑誌名: Chem. Sci 巻: Vol. 2 号: 10 ページ: 2057-2062
  • DOI: 10.1039/c1sc00386k
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural Dynamics of<i>Ec</i>DOS Heme Domain Revealed by Time-Resolved Ultraviolet Resonance Raman Spectroscopy (2011)
  • 著者名/発表者名: El-Mashtoly, Samir; Kubo, Minoru; Nakashima, Satoru; Shimizu, Toru; Kitagawa, Teizo
  • 雑誌名: J. Phys. Chem. Lett. 巻: 2 号: 17 ページ: 2212-2217
  • DOI: 10.1021/jz201017y
  • 査読あり
• [雑誌論文] Spectroscopic identification of reactive porphyrin motions (2011)
  • 著者名/発表者名: Barabanschikov, A., Demidov, A., Kubo, M., Champion, P.M., Sage, J.T., Zhao, J., Sturhahn, W., Alp, E.E.
  • 雑誌名: J.Chem.Phys. 巻: 135 号: 1
  • DOI: 10.1063/1.3598473
  • 査読あり
• [雑誌論文] Chromium(V)-oxo and chromium(III)-superoxo complexes bearing a macrocyclic TMC ligand in hydrogen atom abstraction reactions (2011)
  • 著者名/発表者名: Cho, J., Woo, J., Han, J.E., Kubo, M., Ogura, T., Nam, W.
  • 雑誌名: Chem.Sci. 巻: 2 ページ: 2057-2062
  • 査読あり
• [雑誌論文] Spectroscopic and computational characterization of Cu^<II>-OOR (R=H or Cumyl) complexes bearing a Me_6-tren ligand (2011)
  • 著者名/発表者名: Choi, Y.J., Cho, K.-B., Kubo, M., Ogura, T., Karlin, K.D., Cho, J., Nam, W.
  • 雑誌名: Dalton Trans. 巻: 40 号: 10 ページ: 2234-2241
  • DOI: 10.1039/c0dt01036g
  • 査読あり
• [学会発表] X線結晶構造解析と振動分光法の併用によるタンパク質の動的精密構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 久保稔
  • 学会等名: 大阪大学蛋白質研究所セミナー"結晶構造を併用したハイブリッド構造研究の最前線"
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2014-02-08
  • 招待講演
• [学会発表] フロー・フラッシュ過渡吸収分光法による一酸化窒素還元酵素のNO還元反応機構の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 木村哲就，當舎武彦，城宜嗣，久保稔
  • 学会等名: 第14回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 横浜
• [学会発表] X線結晶構造解析と振動分光法の併用によるタンパク質の動的精密構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 久保稔
  • 学会等名: 大阪大学蛋白質研究所セミナー “結晶構造を併用したハイブリッド構造研究の最前線”
  • 発表場所: 大阪
  • 招待講演
• [学会発表] Development of micro-channel flow-flash method for time-resolved spectroscopic study of enzymatic reactions (2013)
  • 著者名/発表者名: 木村哲就,當舎武彦,城宜嗣,久保稔
  • 学会等名: 日本生物物理学会,第51回年会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2013-10-28
• [学会発表] 酵素反応の観測を可能にする振動分光技術の開発と展望 (2013)
  • 著者名/発表者名: 久保稔
  • 学会等名: 第13回日本蛋白質科学会年会,ワークショップ"蛋白質機能を化学的に理解するために"
  • 発表場所: 鳥取
  • 年月日: 2013-06-12
  • 招待講演
• [学会発表] Development of a high-sensitivity time-resolved infrared spectrometer and its application to cytochrome c oxidase in aqueous solution (2013)
  • 著者名/発表者名: Kubo, M., Nakashima, S., Yamaguchi, S., Ogura, T., Mochizuki, M., Kang, J., Tateno, M., Shinzawa-Itoh, K., Kato, K., Yoshikawa, S
  • 学会等名: International Conference on Structural Genomics-Structural Life Science (ICSG-2013-SLS)
  • 発表場所: Sapporo (Japan)
• [学会発表] Real time observation of water-channel closure controlled by Cu_B in bovine cytochrome c oxidase using a novel high-sensitivity infrared system (2013)
  • 著者名/発表者名: Kubo, M., Nakashima, S., Yamaguchi, S., Ogura, T., Mochizuki, M., Kang, J., Tateno, M., Shinzawa-Itoh, K., Kato, K., Yoshikawa, S
  • 学会等名: 16th International Conference on Biological Inorganic Chemistry (ICBIC-16)
  • 発表場所: Grenoble (France)
• [学会発表] Development of micro-channel flow-flash method for time-resolved spectroscopic study of enzymatic reactions (2013)
  • 著者名/発表者名: 木村哲就，當舎武彦，城宜嗣，久保稔
  • 学会等名: 日本生物物理学会 第51回年会
  • 発表場所: 京都
• [学会発表] Development of a high-sensitivity time-resolved infrared spectrometer and its application to cytochrome c oxidase in aqueous solution (2013)
  • 著者名/発表者名: Kubo, M., Nakashima, S., Yamaguchi, S., Ogura, T., Mochizuki, M., Kang, J., Tateno, M., Shinzawa-Itoh, K., Kato, K., Yoshikawa, S.
  • 学会等名: International Conference on Structural Genomics-Structural Life Science (ICSG-2013-SLS)
  • 発表場所: 札幌
• [学会発表] Real time observation of water-channel closure controlled by CuB in bovine cytochrome c oxidase using a novel high-sensitivity infrared system (2013)
  • 著者名/発表者名: Kubo, M., Nakashima, S., Yamaguchi, S., Ogura, T., Mochizuki, M., Kang, J., Tateno, M., Shinzawa-Itoh, K., Kato, K., Yoshikawa, S.
  • 学会等名: 16th International Conference on Biological Inorganic Chemistry (ICBIC-16)
  • 発表場所: Grenoble (France)
• [学会発表] 酵素反応の観測を可能にする振動分光技術の開発と展望 (2013)
  • 著者名/発表者名: 久保稔
  • 学会等名: 第13回日本蛋白質科学会年会，ワークショップ “蛋白質機能を化学的に理解するために”
  • 発表場所: 鳥取
  • 招待講演
• [学会発表] Time-resolved IR analyses of proteins using a novel pulse flow system synchronized with pump/probe lasers (2012)
  • 著者名/発表者名: 久保稔, 中島聡, 望月正雄, 伊藤-新澤恭子, 吉川信也, 小倉尚志
  • 学会等名: 日本生物物理学会,第50回年会
  • 発表場所: 名古屋
  • 年月日: 2012-09-24
• [学会発表] Time-resolved IR analyses of proteins using a novel pulse flow system synchronized with pump/probe lasers． (2012)
  • 著者名/発表者名: 久保稔, 中島聡, 望月正雄, 伊藤-新澤 恭子, 吉川信也, 小倉尚志
  • 学会等名: 日本生物物理学会，第50回年会
  • 発表場所: 名古屋
• [学会発表] フェムト秒レーザーを用いた高感度時間分解赤外分光装置の開発と蛋白質水溶液への応用 (2011)
  • 著者名/発表者名: 久保稔, 山口悟, 望月正雄, 伊藤-新澤恭子, 吉川信也, 小倉尚志, 中島聡
  • 学会等名: 平成23年度日本分光学会年次講演会
  • 発表場所: 横浜 (若手講演賞受賞)
  • 年月日: 2011-12-02
• [学会発表] フェムト秒レーザーを用いた高感度時間分解赤外分光装置の開発と蛋白質水溶液への応用 (2011)
  • 著者名/発表者名: 久保稔, 山口悟, 望月正雄, 伊藤-新澤恭子, 吉川信也, 小倉尚志, 中島聡
  • 学会等名: 平成23年度日本分光学会年次講演会
  • 発表場所: 理化学研究所横浜研究所交流棟ホール(神奈川県)(若手講演賞受賞)
  • 年月日: 2011-12-02
• [学会発表] タンパク質の低振動コヒーレンス─Revisited─ (2011)
  • 著者名/発表者名: 久保稔
  • 学会等名: 大阪大学蛋白質研究所セミナー"タンパク質科学の未来を語る:実験・理論研究者の対話"
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2011-11-21
  • 招待講演
• [学会発表] 水溶液中のタンパク質の高感度時間分解赤外分光測定 (2011)
  • 著者名/発表者名: 久保稔,山口悟, 望月正雄, 伊藤-新澤恭子, 吉川信也, 小倉尚志, 中島聡
  • 学会等名: 第5回分子科学討論会
  • 発表場所: 札幌
  • 年月日: 2011-09-20
• [学会発表] 水溶液中の蛋白質の高感度時間分解赤外分光測定 (2011)
  • 著者名/発表者名: 久保稔, 山口悟, 望月正雄, 吉川信也, 小倉尚志, 中島聡
  • 学会等名: 第5回分子科学討論会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター(北海道)
  • 年月日: 2011-09-20
• [学会発表] High-sensitivity time-resolved infrared analyses of proteins, functioning in aqueous solution (2011)
  • 著者名/発表者名: 久保稔
  • 学会等名: 日本生物物理学会,第49回年会シンポジウム"Sail on Quantum Structural Biology ! "
  • 発表場所: 姫路
  • 年月日: 2011-09-17
  • 招待講演
• [学会発表] 水溶液中の蛋白質の高感度時間分解赤外分光解析 (2011)
  • 著者名/発表者名: 久保稔
  • 学会等名: 日本生物物学会第49回年会
  • 発表場所: 兵庫県立大学姫路書写キャンパス(兵庫県)(招待講演)
  • 年月日: 2011-09-17