溶媒クエンチ法と蛋白質工学の融合による巨大蛋白質複合体の構造揺らぎ解析

• 研究課題/領域番号: 23770194
• 研究種目: 若手研究(B)
• 配分区分: 基金
• 研究分野: 生物物理学
• 研究機関: 山形大学 (2012-2013); 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(共通施設) (2011)
• 研究代表者: 真壁 幸樹 山形大学, 理工学研究科, 准教授 (20508072)
• 研究期間 (年度): 2011 – 2013
• 研究課題ステータス: 完了 (2013年度)
• 配分額: 4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円); 2013年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2012年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2011年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
• キーワード: タンパク質工学 / シャペロン / 水素交換 / GroEL / 蛋白質 / 構造揺らぎ / タンパク質 / 水素重水素交換

研究概要

本研究では蛋白質の巻き戻り反応を介助する酵素、大腸菌シャペロニンGroEL/ESの構造揺らぎを明らかにすることを目指した。GroESを用いた溶媒クエンチ水素交換の結果からプロテクションファクターが10の6乗以上のアミドプロトンは10だけであり、フリーのGroESは構造揺らぎが大きいことが示された。また、インテインを融合したGroEL頂上ドメインの大腸菌発現に成功した。GroEL/ESの基質であるαラクトアルブミンのN末端残基変異体の結晶構造解析からは、N末端残基が作る水素結合が安定性に大きく寄与していることが明らかとなった。

研究成果

• [雑誌論文] Dissection of the ATP-dependent conformational change cycle of a group II chaperonin. (2014)
  • 著者名/発表者名: Nakagawa A, Moriya K, Arita M, Yamamoto Y, Kitamura K, Ishiguro N, Kanzaki T, Oka T, Makabe K, Kuwajima K, Yohda M.
  • 雑誌名: J Mol Biol. 巻: 426 号: 2 ページ: 447-459
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2013.09.034
  • 査読あり
• [雑誌論文] The catalytic domain of topological knot tRNA methyltransferase (TrmH) discriminates between substrate tRNA and non-substrate tRNA via an induced-fit process (2013)
  • 著者名/発表者名: Ochi A, Makabe K, Yamagami R, Hirata A, Sakaguchi R, Hou YM, Watanabe K, Nureki O, Kuwajima K, Hori H
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 30
  • 査読あり
• [雑誌論文] ATP dependent rotational motion of group II chaperonin observed by X-ray single molecule tracking (2013)
  • 著者名/発表者名: Sekiguchi H, Nakagawa A, Moriya K, Makabe K, Ichiyanagi K, Nozawa S, Sato T, Adachi S, Kuwajima K, Yohda M, Sasaki YC
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 29
  • 査読あり
• [雑誌論文] NMR characterization of the interaction of GroEL with amyloidβas a model ligand (2013)
  • 著者名/発表者名: Yagi-Utsumi M, Kunihara T, Nakamura T, Uekusa Y, Makabe K, Kuwajima K, Kato K
  • 雑誌名: FEBS Lett 巻: 587 ページ: 1605-9
  • 査読あり
• [雑誌論文] The H/D-exchange Kinetics of the Escherichia coli Co-chaperonin GroES Studied by 2D-NMR and DMSO-Quenched Exchange Methods (2013)
  • 著者名/発表者名: Chandak MS, Nakamura T, Makabe K, Takenaka T, Mukaiyama A, Chaudhuri TK, Kato K, Kuwajima K
  • 雑誌名: J Mol Biol 巻: 425 ページ: 2541-60
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular mechanisms of the cytotoxicity of humanα-lactalbumin made lethal to tumor cells (HAMLET) and other protein-oleic acid complexes (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakamura T, Aizawa T, Kariya R, Okada S, Demura M, Kawano K, Makabe K, Kuwajima K
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 288 ページ: 14408-14416
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural insights into the stability perturbations induced by N-terminal variation in human and goatα-lactalbumin (2013)
  • 著者名/発表者名: Makabe K, Nakamura T, Kuwajima K
  • 雑誌名: Protein Eng Des Sel 巻: 26 ページ: 165-170
  • 査読あり
• [雑誌論文] The Molten Globule ofβ2-Microglobulin Accumulated at pH 4 and Its Role in Protein Folding (2013)
  • 著者名/発表者名: Mukaiyama A, Nakamura T, Makabe K, Maki K, Goto Y, Kuwajima K
  • 雑誌名: J Mol Biol 巻: 425 ページ: 273-291
  • 査読あり
• [雑誌論文] Native-state Heterogeneity ofβ2-Microglobulin as Revealed by Kinetic Folding and Real-time NMR Experiments (2013)
  • 著者名/発表者名: Mukaiyama A, Nakamura T, Makabe K, Maki K, Goto Y, Kuwajima K
  • 雑誌名: J Mol Biol 巻: 425 ページ: 257-272
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural insights into the stability perturbations induced by N-terminal variation in human and goat α-lactalbumin. (2013)
  • 著者名/発表者名: Makabe K, Nakamura T, Kuwajima K
  • 雑誌名: Protein Eng Des Sel. 巻: 26 号: 2 ページ: 165-170
  • DOI: 10.1093/protein/gzs093
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular mechanisms of the cytotoxicity of human α-lactalbumin made lethal to tumor cells (HAMLET) and other protein-oleic acid complexes. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakamura T, Aizawa T, Kariya R, Okada S, Demura M, Kawano K, Makabe K, Kuwajima K.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 巻: 288 号: 20 ページ: 14408-14416
  • DOI: 10.1074/jbc.m112.437889
  • 査読あり
• [雑誌論文] The H/D-exchange Kinetics of the Escherichia coli Co-chaperonin GroES Studied by 2D-NMR and DMSO-Quenched Exchange Methods. (2013)
  • 著者名/発表者名: Chandak MS, Nakamura T, Makabe K, Takenaka T, Mukaiyama A, Chaudhuri TK, Kato K, Kuwajima K.
  • 雑誌名: J Mol Biol. 巻: 425 号: 14 ページ: 2541-2560
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2013.04.008
  • 査読あり
• [雑誌論文] NMR characterization of interaction of GroEL with amyloid β as a model ligand. (2013)
  • 著者名/発表者名: M.Yagi-Utsumi, T.Kunihara, T.Nakamura, Y.Uekusa, K.Makabe, K.Kuwajima, and K.Kato
  • 雑誌名: FEBS Lett. 巻: 587 号: 11 ページ: 605-609
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2013.04.007
  • 査読あり
• [雑誌論文] ATP dependent rotational motion of group II chaperonin observed by X-ray single molecule tracking. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sekiguchi H, Nakagawa A, Moriya K, Makabe K, Ichiyanagi K, Nozawa S, Sato T, Adachi S, Kuwajima K, Yohda M, Sasaki YC.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 8 号: 5 ページ: e64176-e64176
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0064176
  • 査読あり
• [雑誌論文] The catalytic domain of topological knot tRNA methyltransferase (TrmH) discriminates between substrate tRNA and nonsubstrate tRNA via an induced-fit process. (2013)
  • 著者名/発表者名: A. Ochi, K. Makabe, R. Yamagami, A. Hirata, R. Sakaguchi, Y.M. Hou, K. Watanabe, O. Nureki, K. Kuwajima, and H. Hori
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 288 号: 35 ページ: 25562-25574
  • DOI: 10.1074/jbc.m113.485128
  • 査読あり
• [雑誌論文] Native-state heterogeneity of β(2)-microglobulin as revealed by kinetic folding and real-time NMR experiments. (2013)
  • 著者名/発表者名: Mukaiyama A, Nakamura T, Makabe K, Maki K, Goto Y, Kuwajima K.
  • 雑誌名: J Mol Biol. 巻: 425 号: 2 ページ: 257-272
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2012.11.004
  • 査読あり
• [雑誌論文] The molten globule of β(2)-microglobulin accumulated at pH 4 and its role in protein folding (2013)
  • 著者名/発表者名: A. Mukaiyama, T. Nakamura, K. Makabe, K. Maki, Y. Goto, K. Kuwajima
  • 雑誌名: J. Mol. Biol. 巻: 425 号: 2 ページ: 273-291
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2012.11.002
  • 査読あり
• [雑誌論文] Sequential Four-state Folding/unfolding of Goatα-Lactalbumin and Its N-Terminal Variants Proteins (2012)
  • 著者名/発表者名: Tomoyori K, Nakamura T, Makabe K, Maki K, Saeki K, Kuwajima K
  • 巻: 80
  • ページ: 2191-206
  • 査読あり
• [雑誌論文] Fibrillogenic propensity of the GroEL apical domain : A Janus-faced minichaperone (2012)
  • 著者名/発表者名: Chen J, Yagi H, Sormanni P, Vendruscolo M, Makabe K, Nakamura T, Goto Y, Kuwajima K
  • 雑誌名: FEBS Letters 巻: 586 ページ: 1120-1127
  • 査読あり
• [雑誌論文] Sequential four-state folding/unfolding of goat α-lactalbumin and its N-terminal variants. (2012)
  • 著者名/発表者名: Tomoyori K, Nakamura T, Makabe K, Maki K, Saeki K, Kuwajima K.
  • 雑誌名: Proteins. 巻: 80 号: 9 ページ: 2191-2206
  • DOI: 10.1002/prot.24109
  • 査読あり
• [雑誌論文] Fibrillogenic propensity of the GroEL apical domain: A Janus-faced minichaperone (2012)
  • 著者名/発表者名: Chen J, Yagi H, Sormanni P, Vendruscolo M, Makabe K, Nakamura T, Goto Y, Kuwajima K.
  • 雑誌名: FEBS Letters 巻: 586 ページ: 1120-1127
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dissecting a Bimolecular Process of MgATP2- Binding to the Chaperonin GroEL (2011)
  • 著者名/発表者名: Chen J, Makabe K, Nakamura T, Inobe T, Kuwajima K
  • 雑誌名: J Mol Biol 巻: 410 ページ: 343-356
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dissecting a bimolecular process of MgATP2- binding to the chaperonin GroEL. (2011)
  • 著者名/発表者名: Chen J, Makabe K, Nakamura T, Inobe T, Kuwajima K.
  • 雑誌名: J Mol Biol 巻: 412 ページ: 343-356
  • 査読あり
• [学会発表] Folding and redesign of a beta-sheet rich model protein (2013)
  • 著者名/発表者名: Koki Makabe
  • 学会等名: International symposium on protein folding and its biological significance
  • 発表場所: 岡崎
  • 年月日: 2013-03-05
  • 招待講演
• [学会発表] Folding and redesign of a beta-sheet rich model protein (2013)
  • 著者名/発表者名: Koki Makabe
  • 学会等名: International symposium on protein folding and its biological significance
  • 発表場所: Okazaki, Japan
  • 招待講演
• [学会発表] モデル蛋白質によるβシート構造の再設計 (2012)
  • 著者名/発表者名: 真壁幸樹
  • 学会等名: 平成24年生物物理学会東北支部会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2012-12-21
• [学会発表] STRUCTURAL INSIGHTS INTO THE STABILITY PERTURBATIONS BY N-TERMINAL VARIATIONS IN HUMAN AND GOAT ALPHA-LACTALBUMIN (2012)
  • 著者名/発表者名: Koki Makabe, Takashi Nakamura and Kunihiro Kuwajima
  • 学会等名: Korea-Japan Seminars on Biomolecular Sciences Experiments and Simulations
  • 発表場所: 奈良
  • 年月日: 2012-01-09
  • 招待講演
• [学会発表] STRUCTURAL INSIGHTS INTO THE STABILITY PERTURBATIONS BY N-TERMINAL VARIATIONS IN HUMAN AND GOAT ALPHA-LACTALBUMIN (2012)
  • 著者名/発表者名: Koki Makabe, Takashi Nakamura and Kunihiro Kuwajima
  • 学会等名: Korea-Japan Seminars on Biomolecular Sciences Experiments and Simulations(招待講演)
  • 発表場所: 東大寺文化センター（奈良県）
• [備考]
  • URL: https://makabe.yz.yamagata-u.ac.jp
• [産業財産権] 蛋白質―化学療法剤複合体及びその製造方法,並びに医薬への応用 (2012)
  • 発明者名: 桑島邦博,中村敬,真壁幸樹,岡田誠治
  • 権利者名: 分子科学研究所、熊本大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2012-147492
  • 出願年月日: 2012
• [産業財産権] 球状蛋白質の準安定状態を用いた抗癌細胞作用のある分子の作成 (2011)
  • 発明者名: 桑島邦博,中村敬,真壁幸樹
  • 権利者名: 分子科学研究所
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2011-238611
  • 出願年月日: 2011
• [産業財産権] 蛋白質-脂肪酸複合体及び腫瘍細胞の細胞死誘導薬 (2011)
  • 発明者名: 桑島邦博、中村敬、真壁幸樹
  • 権利者名: 自然科学研究機構
  • 産業財産権番号: 2011-238611
  • 出願年月日: 2011