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Type I CRISPR ゲノム編集機構の解明に基づく新規遺伝子編集法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 23H00367
研究種目

基盤研究(A)

配分区分補助金
応募区分一般
審査区分 中区分43:分子レベルから細胞レベルの生物学およびその関連分野
研究機関東京大学

研究代表者

真下 知士  東京大学, 医科学研究所, 教授 (80397554)

研究分担者 吉見 一人  東京大学, 医科学研究所, 准教授 (50709813)
石田 紗恵子  東京大学, 医科学研究所, 助教 (50777927)
竹下 浩平  国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 研究員 (80346808)
研究期間 (年度) 2023-04-01 – 2028-03-31
研究課題ステータス 交付 (2025年度)
配分額 *注記
46,410千円 (直接経費: 35,700千円、間接経費: 10,710千円)
2025年度: 9,100千円 (直接経費: 7,000千円、間接経費: 2,100千円)
2024年度: 9,100千円 (直接経費: 7,000千円、間接経費: 2,100千円)
2023年度: 10,010千円 (直接経費: 7,700千円、間接経費: 2,310千円)
キーワードゲノム編集 / CRISPR-Cas3 / in vitroゲノム編集 / in vivoゲノム編 / 核酸検出法 / モデル動物 / 原子間力顕微鏡 / コラテラル切断 / 受精卵 / 遺伝子改変マウス / 脂質ナノ粒子 / 診断薬 / in vivoゲノム編集 / マウス
研究開始時の研究の概要

我々は世界で初めてCRISPR-Cas3システムを用いて、真核細胞におけるゲノム編集に成功した。「ハサミ」のようなCas9と異なり、Cas3は「シュレッダー」のように数キロに渡る大きな欠失変異を導入する。一方、Cas3には欠失範囲の制御などいくつかの課題が存在する。本研究では1)Cas3独自のゲノム編集メカニズムの解明、2)ヒトHEK細胞、iPS細胞等での効率的なゲノム編集、3)マウス受精卵編集および体細胞ゲノム編集、4)感染症診断等の核酸検出CONAN法の開発を行う。新しく開発された様々なCRISPR-Cas3ゲノム編集法は、基礎研究、モデル動物、診断薬、遺伝子治療等の発展に寄与する。

研究実績の概要

1~4)の研究テーマに沿って、CRISPR-Cas3ゲノム編集メカニズムの解明、細胞、受精卵、動物個体でのゲノム編集効率の向上と改善、新規ゲノム編集技術の開発を行った。新しく開発された様々なCRISPR-Cas3ゲノム編集法は、基礎研究、モデル動物、診断薬、遺伝子治療等の発展に寄与する。
1)CRISPR-Cas3ゲノム編集/DNA修復メカニズムの解明:Octetバイオレイヤー干渉法および高速原子間力顕微鏡HS-AFMにより、Cas3による二本鎖DNA切断する瞬間をとらえ、ヘリカーゼ活性によるリール(巻取り)およびループ構造の形成、コラテラル切断を利用した大規模ゲノム欠失メカニズム(インターフェアランス)を解明した。
2)様々な細胞におけるCas3ゲノム編集:ヒトHEK細胞、ヒトプライマリーT細胞、ヒト造血幹細胞、およびiPS細胞等において、プラスミドおよびタンパク質導入によるCas3ゲノム編集を実施して、FACSおよびデジタルPCRにより10-70%のゲノム編集効率を得ることができた。
3)モデル動物におけるin vivoゲノム編集:受精卵にCas3 修飾mRNA/crRNAを導入することで、10-40%の高率で標的遺伝子ノックアウトマウス・ラット作製に成功した。Cas3-修飾mRNA/crRNAを内包した脂質ナノ粒子LNPにより、マウスで尾静注により肝臓での10-50%のin vivo編集に成功した。
4)感染症診断や遺伝子診断に利用する新しい核酸検出法CONAN:PCRでの増幅では難しい数百の繰返し配列(リピート病)について、繰返し配列特異的crRNAにより、定量性のある診断法および迅速遺伝診断スクリーニング法を開発した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

計画通り1~4)の研究テーマに沿って、以下の通りCRISPR-Cas3ゲノム編集メカニズムの解明、細胞、受精卵、動物個体でのゲノム編集効率の向上と改善、新規ゲノム編集技術の開発を行うことができたために、(2)おおむね順調に評価していると自己評価する。
1)CRISPR-Cas3ゲノム編集/DNA修復メカニズムの解明:CRISPR-Cas3による二本鎖DNA切断の切断する瞬間を世界で初めてとらえることに成功した。各種Cas蛋白を別々に精製することに成功し、分子間相互作用等の解析やcrRNAと混ぜることでin vitroおよびin vivoでゲノム編集することに成功して、特許申請の準備を行っている。
2)様々な細胞におけるCas3ゲノム編集:ヒトHEK細胞、Jurkatリンパ球細胞、ヒト造血幹細胞、およびiPS細胞等において、divided-in-two (Dit)プラスミドあるいは上述Cas3リコンビナントタンパク質を利用することで、各種細胞でエレクトロポレーション、培地条件などを検討することで、効率的なCas3ゲノム編集プロトコールを作成することができた(論文準備中)。
3)モデル動物におけるin vivoゲノム編集:修飾mRNA/crRNAを利用することで、マウス・ラット受精卵にCas3導入することで、効率的な標的遺伝子ノックアウト動物の作成を行うことができた(論文投稿中)。Cas3-修飾mRNA/crRNAを内包した脂質ナノ粒子LNPにより、マウスで尾静注により肝臓での効率的なin vivo編集に成功することができた(論文準備中)。
4)感染症診断や遺伝子診断に利用する新しい核酸検出法CONAN:数百から数千の繰返し配列について、繰返し配列特異的crRNAをデザインすることで、定量性のある診断法を開発することに成功した(論文投稿中)。

今後の研究の推進方策

今後も引き続き、1~4)の研究テーマに沿って、CRISPR-Cas3ゲノム編集メカニズムの解明、細胞、受精卵、動物個体でのゲノム編集効率の向上と改善を行う。
1)CRISPR-Cas3ゲノム編集/DNA修復メカニズムの解明:各種Cas蛋白の精製、分子間相互作用等によりCascade/Cas3/crRNAがどのように形成されるかプロセシングメカニズムの解明を目指す。タイプⅠCRISPRに利用される新規Casトランスポゾン等を利用して、ヒト細胞における効率的な遺伝子改変およびノックインを目指す。
2)様々な細胞におけるCas3ゲノム編集:ヒトHEK細胞、造血幹細胞、iPS細胞等において、mRNA導入によるゲノム編集を実施する。crRNA導入方法、サイズ、修飾等を検討する。FACS、Amplicon-seq、デジタルPCRによりノックアウト効率、ドナーDNAを用いたノックイン効率の向上を目指す。
3)モデル動物におけるin vivoゲノム編集:マウス受精卵においてCas3 RNP, mRNAを用いてさらにゲノム編集を実施する。修飾crRNA、ゲノム編集エンハンサーあるいはDNA修復機構の改善により、受精卵における効率的なCas3ゲノム編集を目指す。Cas9-mRNAを内包した脂質ナノ粒子LNPにより、ヒト細胞でCas3ゲノム編集を行う。マウスで尾静注、筋注によりさらに肝臓、筋肉細胞でのin vivo編集を試みる。
4)感染症診断や遺伝子診断に利用する新しい核酸検出法CONAN:CONANを利用して、新型コロナおよびインフルエンザ同時診断法を開発する。PCRでの増幅では難しい数百の繰返し配列(リピート病)について、繰返し配列特異的crRNAにより、簡便、迅速遺伝診断スクリーニング法のさらなる開発を目指す。

報告書

(2件)
  • 2023 審査結果の所見   実績報告書
  • 研究成果

    (22件)

すべて 2024 2023

すべて 雑誌論文 (13件) (うち国際共著 4件、 査読あり 9件、 オープンアクセス 9件) 学会発表 (7件) (うち国際学会 2件、 招待講演 7件) 産業財産権 (2件)

  • [雑誌論文] Brca2(p.T1942fs/+) dissipates ovarian reserve in rats through oxidative stress in follicular granulosa cells.2024

    • 著者名/発表者名
      Tanaka H, Motooka Y, Maeda Y, Sonehara R, Nakamura T, Kajiyama H, Mashimo T, Toyokuni S.
    • 雑誌名

      Free Radic Res

      巻: 58(2) 号: 2 ページ: 130-143

    • DOI

      10.1080/10715762.2024.2320405

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] A missense mutation in the Hspa8 gene encoding heat shock cognate protein 70 causes neuroaxonal dystrophy in rats2024

    • 著者名/発表者名
      Tanaka M, Fujikawa R, Sekiguchi T, Johnson OT, Tanaka D, Kumafuji K, Serikawa T, Trung HH, Hattori K, Mashimo T, Kuwamura M, Gestwicki JE, Kuramoto T
    • 雑誌名

      Frontiers in Neuroscience

      巻: 18 ページ: 0-0

    • DOI

      10.3389/fnins.2024.1263724

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] A novel Kit mutant rat enables hematopoietic stem cell engraftment without irradiation2024

    • 著者名/発表者名
      Iida Ryuya、Ishida Saeko、Wang Jinxi、Hattori Kosuke、Yoshimi Kazuto、Yamazaki Satoshi、Mashimo Tomoji
    • 雑誌名

      Experimental Hematology

      巻: 132 ページ: 104174-104174

    • DOI

      10.1016/j.exphem.2024.104174

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] ゲノム編集技術のオーバービューおよび医療応用をめぐる国内外の動向2024

    • 著者名/発表者名
      真下 知士
    • 雑誌名

      実験医学

      巻: Vol.42 No.6 ページ: 870-875

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [雑誌論文] Remnant tissue enhances early postoperative biomechanical strength and infiltration of Scleraxis-positive cells within the grafted tendon in a rat anterior cruciate ligament reconstruction model2023

    • 著者名/発表者名
      Kawakami Junki, Hisanaga Satoshi ,Yoshimoto Yuki (他11名) Okamoto Nobukazu、Masuda Tetsuro、Miyamoto Takeshi
    • 雑誌名

      PLOS ONE

      巻: 18 号: 11 ページ: 0293944-0293944

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0293944

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Protocol for highly selective transgene expression through the flip-excision switch system by using a unilateral spacer sequence in rodents2023

    • 著者名/発表者名
      Matsushita Natsuki、Kato Shigeki、Nishizawa Kayo、Sugawara Masateru、Takeuchi Kosei、Miyasaka Yoshiki、Mashimo Tomoji、Kobayashi Kazuto
    • 雑誌名

      STAR Protocols

      巻: 4 号: 4 ページ: 102667-102667

    • DOI

      10.1016/j.xpro.2023.102667

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Hydrogen sulfide and polysulfides induce GABA/glutamate/d-serine release, facilitate hippocampal LTP, and regulate behavioral hyperactivity2023

    • 著者名/発表者名
      Hiroki Furuie#、Yuka Kimura#、Tatsuhiro Akaishi#、Misa Yamada、Yoshiki Miyasaka、Akiyoshi Saitoh、Norihiro Shibuya、Akiko Watanabe、Naoki Kusunose、Tomoji Mashimo、Takeo Yoshikawa、Mitsuhiko Yamada、Kazuho Abe、Hideo Kimura
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 13 号: 1 ページ: 1-19

    • DOI

      10.1038/s41598-023-44877-y

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] BRCA1 haploinsufficiency impairs iron metabolism to promote chrysotile‐induced mesothelioma via ferroptosis resistance2023

    • 著者名/発表者名
      Luo Yaguang、Akatsuka Shinya、Motooka Yashiro、Kong Yingyi、Zheng Hao、Mashimo Tomoji、Imaoka Tatsuhiko、Toyokuni Shinya
    • 雑誌名

      Cancer Science

      巻: 114 号: 4 ページ: 1423-1436

    • DOI

      10.1111/cas.15705

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Imbalance of glutamatergic and GABAergic neurotransmission in audiogenic seizure-susceptible L?eucine-rich glioma-inactivated 1?(Lgi1)-mutant rats2023

    • 著者名/発表者名
      Masato Kinboshi, Saki Shimizu, Kentaro Tokudome, Tomoji Mashimo, Tadao Serikawa, Hidefumi Ito, Ryosuke Takahashi, Akio Ikeda, Yukihiro Ohno
    • 雑誌名

      Heliyon

      巻: 9 号: 7 ページ: e17984-e17984

    • DOI

      10.1016/j.heliyon.2023.e17984

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] In vivo18F-DOPA PET imaging identifies a dopaminergic deficit in a rat model with a G51D α-synuclein mutation2023

    • 著者名/発表者名
      Morley Victoria、Dolt Karamjit Singh、Alcaide-Corral Carlos J.、Walton Tashfeen、Lucatelli Christophe、Mashimo Tomoji、Tavares Adriana A. S.、Kunath Tilo
    • 雑誌名

      Frontiers in Neuroscience

      巻: 17 ページ: 0-0

    • DOI

      10.3389/fnins.2023.1095761

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] CRISPR-Casシステム―ゲノム編集と医療への応用2023

    • 著者名/発表者名
      吉見 一人, 真下 知士
    • 雑誌名

      日本医師会雑誌

      巻: 第152巻・特別号(1) ページ: 194-197

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [雑誌論文] ゲノム編集ラットの作製と遺伝子治療研究への応用2023

    • 著者名/発表者名
      吉見 一人, 真下 知士
    • 雑誌名

      遺伝子治療開発研究ハンドブック

      巻: 第2版 ページ: 100-104

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [雑誌論文] ゲノム編集技術の応用2023

    • 著者名/発表者名
      石田紗恵子、真下 知士
    • 雑誌名

      医学のあゆみ「mRNAワクチンやゲノム編集で注目が集まる遺伝子治療」

      巻: Vol.285(5) ページ: 328-333

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] ゲノム編集の研究2024

    • 著者名/発表者名
      真下 知士
    • 学会等名
      ゲノム創薬・創発フォーラム第14回シンポジウム
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] ゲノム編集技術による遺伝子改変動物の作製2024

    • 著者名/発表者名
      真下 知士
    • 学会等名
      第4回 有性生殖研究会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] ゲノム編集研究の現状と課題2023

    • 著者名/発表者名
      真下 知士
    • 学会等名
      第87回生化学会中部支部例会・シンポジウム
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] ゲノム編集技術による神経科学研究に有用なモデル動物の開発2023

    • 著者名/発表者名
      真下 知士
    • 学会等名
      第46回日本神経科学大会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] ゲノム編集技術とゲノム編集モデル動物を用いた研究2023

    • 著者名/発表者名
      真下 知士
    • 学会等名
      第26回日本小児心血管分子医学研究会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Genome Editing technologies in mice and rats2023

    • 著者名/発表者名
      真下 知士
    • 学会等名
      AHLAS CONGRESS2023
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Post-Cas9” Genome Editing - Paving the Way for Industrial Applications2023

    • 著者名/発表者名
      真下 知士
    • 学会等名
      JAACT2023
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [産業財産権] 改良されたCRISPR-Cas3システム2024

    • 発明者名
      雑賀啓明、真下知士、吉見一人、村中俊哉、安本周平
    • 権利者名
      雑賀啓明、真下知士、吉見一人、村中俊哉、安本周平
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      2024-042105
    • 出願年月日
      2024
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [産業財産権] CRISPR-Casシステム、標的DNAを編集する方法、標的DNAが編集された細胞を製造する方法、標的DNAを検出する方法、及びキット2024

    • 発明者名
      真下知士、吉見一人、阿部洋、阿部奈保子
    • 権利者名
      真下知士、吉見一人、阿部洋、阿部奈保子
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      2024-047341
    • 出願年月日
      2024
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書

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公開日: 2023-04-13   更新日: 2025-06-20  

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