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超並列ペプチド1分子アミノ酸配列決定法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 23H05456
研究種目

基盤研究(S)

配分区分補助金
審査区分 大区分D
研究機関名古屋大学

研究代表者

村上 裕  名古屋大学, 工学研究科, 教授 (10361669)

研究分担者 日野 智也  鳥取大学, 工学研究科, 准教授 (40373360)
林 剛介  名古屋大学, 工学研究科, 准教授 (40648268)
研究期間 (年度) 2023-04-12 – 2028-03-31
研究課題ステータス 交付 (2025年度)
配分額 *注記
208,650千円 (直接経費: 160,500千円、間接経費: 48,150千円)
2025年度: 26,780千円 (直接経費: 20,600千円、間接経費: 6,180千円)
2024年度: 26,780千円 (直接経費: 20,600千円、間接経費: 6,180千円)
2023年度: 101,530千円 (直接経費: 78,100千円、間接経費: 23,430千円)
キーワード人工抗体 / ペプチド / 一分子配列解析 / 1分子シークエンス / 一分子ペプチド配列決定 / タンパク質
研究開始時の研究の概要

タンパク質配列を1分子で決定することで、これまで見えなかった生命現象が明らかになると期待されている。本研究課題では、TRAP提示法を用いて、エドマン分解試薬で修飾した20種類の天然アミノ酸やその他の翻訳後修飾アミノ酸をN末端にもつ各ペプチドに、特異的に結合する人工抗体群を取得する。次に、ガラス基板上での分析対象ペプチドのN末端を人工抗体で同定し、さらにペプチドを逐次分解して、ペプチドの配列を1分子レベルで決定する。この「超並列ペプチド1分子アミノ酸配列決定法」は、ペプチドの翻訳後修飾を含むアミノ酸配列を1分子レベルで並列的に決定でき、生命科学分野の研究を大きく進展する方法となると考えられる。

研究実績の概要

まず、より良い人工抗体を創出するために、多様性の高い人工抗体ライブラリーを構築した。その際、我々の独自技術であるTRAP提示法の効率を上げるために、効率よくリボソームを停止させる配列を、次世代シークエンサーを用いた解析により見出し、Nucleic Acids Research, 2023, gkad555.に発表した。本配列を用いることで、リボソームのAサイトが空コドンに来た際に、Pサイトに嵩高い塩基をもつtRNAが配置され、空コドンのミスリーディングが抑制され、その結果、ピューロマイシンとペプチジルtRNAの反応が相対的に促進されると予想される。本結果は、人工抗体ライブラリの構築に限らず、環状ペプチドライブラリの構築にも役に立ち、今後、ライブラリ作製にとって重要な知見となる。続いて、N末端アミノ酸特異的な人工抗体の選択に使用するペプチドの合成を行った。ペプチド固相合成とHPLCでの精製を経て、計画していた90種類のすべてのペプチド(20種類の天然アミノ酸+10種類の翻訳後修飾アミノ酸)x(3種類の第二残基)について合成が達成できたことをHPLCと質量分析を用いて確認した。ここで第二残基を3種類調製したのは、様々な第二残基をもつペプチドを標的とすることで、第一残基のみを認識する人工抗体を得るためである。プレ実験として、一部のペプチドについて先行して人工抗体選択実験を行い、得られた人工抗体を大腸菌で発現し、中圧の液体クロマトグラフィーを用いて精製した。分子間相互作用装置で解析した結果、2種類のアミノ酸についてN末端特異的な人工抗体を取得することができたことがわかった。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

多様性の高い人工抗体ライブラリの調製に成功しており、これにより目的の人工抗体を取得する可能性が大きく上がった。本結果はNucleic Acids Research(IF16.9)に掲載された。本配列は、今後の人工抗体と環状ペプチドライブラリー調製に活用され、より高機能の結合分子の取得が可能になると期待される。さらに標的となる90種類のペプチドの合成と精製も完了し、プレ選択実験で得られた人工抗体も、2種類のN末端アミノ酸に対して特異性を示すことが分かった。このように研究は順調に進んでいる。

今後の研究の推進方策

まずビオチン化ペプチド30種類を標的として人工抗体の選択を行う。さらに、予備実験で作製した人工抗体が、新規に購入した相互作用解析装置による解析で有望であることもわかったので、上記の実験と並行して、本人工抗体をもとにして親和性成熟用ライブラリを作製し、上記のペプチドに対して人工抗体の親和性成熟を先行して行う。これについても、人工抗体が2残基目を認識しないように、2残基目のアミノ酸として別のアミノ酸を配置した60種類のペプチドを昨年合成したので、これらを選択操作の際に交互に標的として使用する。さらに酵母提示法を立ち上げてフォローサイトメータとの併用により、非特異的な結合を持つ人工抗体の除去や、より特異的な結合を持つ人工抗体の選択を可能にする。酵母提示法では、TRAP提示法で選択したcDNAを酵母に導入し、人工抗体を酵母表面に発現させ、上記のビオチン化ペプチドを作用させ、蛍光標識したストレプトアビジンで蛍光を付加することで、特定のペプチドを結合する人工抗体を選択する。DNAの配列解析は、昨年購入した次世代シークエンサーで行う。また、実験の多様化に伴い、本年度は担当の学生を3人から6人へと倍増する。これにより、研究のスピードをさらに加速できると考えている。

報告書

(3件)
  • 2023 研究概要(採択時) ( PDF )   審査結果の所見   実績報告書
  • 研究成果

    (9件)

すべて 2024 2023

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (7件) (うち国際学会 1件、 招待講演 2件) 図書 (1件)

  • [雑誌論文] Large-scale analysis of mRNA sequences localized near the start and amber codons and their impact on the diversity of mRNA display libraries2023

    • 著者名/発表者名
      Shun Umemoto , Taishi Kondo , Tomoshige Fujino , Gosuke Hayashi , Hiroshi Murakami
    • 雑誌名

      Nucleic Acids Research

      巻: 51 号: 14 ページ: 7465-7479

    • DOI

      10.1093/nar/gkad555

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] 進化工学で人工タンパク質を創製し新技術を開発する2024

    • 著者名/発表者名
      村上裕
    • 学会等名
      第23回フロンティア生命化学研究会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 進化工学で人工タンパク質を創製し新技術を開発する2023

    • 著者名/発表者名
      村上裕
    • 学会等名
      第75回日本生物工学会大会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] In vitro selection of antibody-like proteins against small molecules2023

    • 著者名/発表者名
      村上裕
    • 学会等名
      The 19th Akabori Conference(German-Japanese Symposium on Peptide Science)
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] mRNA提示法における人工抗体モノボディ・大環状ペプチドライブラリの多様性最大化2023

    • 著者名/発表者名
      梅本駿,近藤太志,藤野公茂,林剛介,村上裕
    • 学会等名
      第46回日本分子生物学会年会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] mRNA提示法のライブラリ多様性に対してmRNA配列が与える影響の大規模解析2023

    • 著者名/発表者名
      梅本駿,近藤太志,藤野公茂,林剛介,村上裕
    • 学会等名
      第17回バイオ関連化学シンポジウム
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] 1分子ペプチドアミノ酸配列決定法の開発を目指したN末端Gly・Phe結合人工抗体の創製2023

    • 著者名/発表者名
      菅野晃矢,近藤太志,梅本駿,藤野公茂,林剛介,村上裕
    • 学会等名
      第17回バイオ関連化学シンポジウム
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] Large-scale Analysis of the Effect of mRNA Sequences on the diversity of mRNA display libraries2023

    • 著者名/発表者名
      梅本駿,近藤太志,藤野公茂,林剛介,村上裕
    • 学会等名
      第24回日本RNA学会年会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [図書] 1分子ペプチドのアミノ酸配列解析は可能か-革新的なプロテオミクス技術の開発2023

    • 著者名/発表者名
      梅本駿 , 村上裕
    • 総ページ数
      2
    • 出版者
      化学同人
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書

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公開日: 2023-04-13   更新日: 2025-06-20  

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