高活性触媒的標的RNA切断機能付与型人工核酸の構築と革新的治療基盤としての展開

• 研究課題/領域番号: 23H05465
• 研究種目: 基盤研究(S)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 大区分E
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 和田 健彦 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (20220957)
• 研究分担者: 児玉 栄一 東北大学, 災害科学国際研究所, 教授 (50271151) ; 稲垣 雅仁 名古屋大学, 理学研究科, 特任助教 (60881092) ; 林 宏典 東北大学, 災害科学国際研究所, 助教 (00752916) ; 荒木 保幸 東北大学, 多元物質科学研究所, 准教授 (80361179) ; 西嶋 政樹 和歌山工業高等専門学校, 総合教育科, 講師 (70448017)
• 研究期間 (年度): 2023-04-12 – 2028-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2025年度)
• 配分額: 203,970千円 (直接経費: 156,900千円、間接経費: 47,070千円); 2025年度: 21,060千円 (直接経費: 16,200千円、間接経費: 4,860千円); 2024年度: 75,270千円 (直接経費: 57,900千円、間接経費: 17,370千円); 2023年度: 44,330千円 (直接経費: 34,100千円、間接経費: 10,230千円)
• キーワード: 核酸医薬 / 触媒的切断 / RNase H / 薬効向上 / オフターゲット効果低減 / 切断機構解明 / 基盤技術 / 構造解析 / RNA / 治療基盤 / 触媒的RNA切断

研究開始時の研究の概要

本研究では我々が開発した"高活性触媒機能付与型核酸医薬"を、新たな新興・再興感染症や膵臓癌に代表される難治性疾患治療薬として活用するための創薬技術基盤開発研究に取組む。核酸医薬の実用化に向けた大きな解決課題とされている、極少ない細胞内導入量に起因する低い治療効果問題を解決するため、RNase Hの標的RNA選択的消化機能を活用し、次世代の分子標的薬として期待されている核酸医薬を用い、ウイルスのゲノムRNAや癌転移・悪性化誘導タンパク質コーディングmRNAを標的とした直接的増殖抑制による治療法構築を目指す。

研究実績の概要

本研究では、我々が開発した高活性触媒的標的RNA切断機能付与型人工核酸(キメラ人工核酸: CANA)を活用し、COVID-19をモデルとし新興・再興感染症や癌など対する新たな治療薬基盤構築を目指している。
具体的には次世代の分子標的薬モダリティーとして期待されている核酸医薬の実用化に向けた深刻な解決課題である、極少ない細胞内導入量に起因する低い治療効果の向上に向け、CANAの機能発現機構解明と機能向上に資する配列・構造設計指針構築に資する基礎的データ取得研究に取組み、その知見に基づきCOVID-19の病因ウイルスであるSARS-CoV-2ゲノムRNAを標的とした直接的切断による感染・増殖抑制による治療薬への展開を計画している。令和5年度はCANA戦略の鍵となる、1．CANA・RNA二重鎖複合体形成・解離過程の解析に取り組み、熱力学パラメータを算出し、物理化学的解析に成功した。また2．CANA・RNA二重鎖とRNase H複合体のCryoEMによる構造解析に取組み、基本技術の習得と、構造解析に供するヒト型RNase Hの大量合成法の構築に取組んだ、加えてSARS-CoV-2の感染・増殖抑制に資する標的候補ゲノムRNAに対するCANAの設計・合成にも取組み、8種類のCANAを合成し各種in vitro実験による標的RNAとの複合体特性解析に成功し、細胞試験、そして健全マウス気管投与による安全性試験を検討し、重要なデータを取得した。並行して今後の研究推進の礎となるキメラ人工核酸の高効率かつ大量合成法の確立にも取組み、市販されていないCANA用Fmoc-PNAモノマー合成法の最適化と外部委託により大量合成し、本科研費によりペプチド自動合成機を購入し、DNA部位とのカップリング合成条件の最適化によりmgスケール合成を可能とした。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

令和5年度の研究により、キメラ人工核酸の合理的設計に向けた標的RNAとの二重鎖複合体形成・解離過程の物理化学的解析に取り組み、熱力学パラメータの算出によるCANAの合理的設計に資する初期的データ取得に成功し、この設計指針に基づき新規CANAの合理的設計と得られたCANAの特性解析からその有効性確認に成功した。さらにミスマッチとダブルミスマッチ塩基を導入した標的類似配列RNAとのCANA二重鎖複合体の安定性を比較検討し詳細に検討した結果、ミスマッチ塩基の複合体安定性に及ぼす影響を詳細に検討し、DNA部位、PNA部位のみならず、従来標的塩基配列認識性が解明されていなかったジャンクション部位においてもミスマッチ塩基により安定性の大きな低下（シングルミスマッチで5―8度、ダブルミスマッチでは15度－27度）が観測され、正確に塩基配列を認識していることが明らかとなった。これらデータは今後の研究推進の鍵となる重要な基礎的データであり、当初は計画していなかった予想以上の研究進展と判断される。
一方、治療薬としての展開研究に関しては、COVID-19感染モデル細胞試験において良好な感染・増殖抑制効果を示したキメラ人工核酸を用い、健全マウス気管投与による安全性試験に取り組み、未投与の対照群と比較して行動・体重などに差異が観測されず、また解剖による臓器所見においても気管支・肺胞に変化は観測されず、キメラ人工核酸のマウス試験による安全性確認に成功した。
このように当初の研究計画では想定していなかった合理的設計指針構築に有益な初期的データ取得とその有効性実証に成功し、さらにマウス試験による安全性確認という極めて有益な知見取得に成功したことから、当初計画以上に進展していると判断される。

今後の研究の推進方策

本研究では我々が初期的知見を取得した「高活性触媒的標的RNA切断機能付与型人工核酸(キメラ人工核酸)：CANA」の位置選択的標的RNA切断メカニズムや触媒回転数増加機構に対する物理化学的検討、そして複合体構造や機能解明に基づく基礎的研究を推進し、高活性触媒的標的RNA切断機能が一般性と普遍性を有することを構造化学と生物学的活性評価など種々の解析手法を用い相関解明を目指している。
令和5年度の研究により、1．CANA・RNA二重鎖複合体形成・解離過程のUV融解曲線のフィッティングにより初期的ではあるが熱力学パラメータの算出と初期的合理的設計指針の構築に成功したが、本年度はカーブフィッティング法により得られたパラメーターの信頼性について、より信頼性の高いITCと温度変化SPR装置を用い詳細に検討する。また 2．CANA・RNA二重鎖とRNase H複合体の解明に関しては、令和5年度の続きCryoEMによる解析研究を推進する。具体的には遺伝子工学手法を用いヒト型RNase Hの効率的合成条件の最適化を検討し、CANA・RNA二重鎖との複合体形成とCryoEM用スライスサンプル作成に取組む。並行して市販の大腸菌型RNase Hとの複合体形成とスライスサンプル作成も検討する。
治療薬としての展開研究に関しては、令和5年度の研究により得られたSARS-CoV-2のゲノムRNAの治療標的候補配列に対する複数種類のCANAを合理的に設計し、令和5年度に構築したDNA自動合成機とペプチド自動合成機を活用した高効率合成法により合成し、各種in vitro実験により標的RNAとの二重鎖複合体の特性解析を行い、これらデータを活用しCOVID-19感染モデル細胞系でSARS-CoV-2感染・増殖抑制効果を指標として機能評価を進め、COVID-19治療薬として配列と構造最適化に取り組む。

研究成果

• [国際共同研究] ボルドー大学(フランス)
• [雑誌論文] Improving diagnostic accuracy of blood culture-positive cases in a cancer center via an antimicrobial stewardship program and infectious disease consultations (2024)
  • 著者名/発表者名: Itoh Naoya、Akazawa Nana、Kawabata Takanori、Yamaguchi Makoto、Kodama Eiichi N.、Ohmagari Norio
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 14 号: 1 ページ: 2869-2869
  • DOI: 10.1038/s41598-024-53543-w
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Real-world effectiveness of full and booster mRNA vaccination for coronavirus disease 2019 against disease severity during the delta- and omicron-dominant phases: A propensity score-matched cohort study using the nationwide registry data in Japan (2024)
  • 著者名/発表者名: Suzuki Tetsuya、Asai Yusuke、Tsuzuki Shinya、Nomoto Hidetoshi、Matsunaga Nobuaki、Kodama Eiichi N.、Hayakawa Kayoko、Ohmagari Norio
  • 雑誌名: Journal of Microbiology, Immunology and Infection 巻: 57 号: 1 ページ: 20-29
  • DOI: 10.1016/j.jmii.2023.12.002
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Development and Comparison of 4-Thiouridine to Cytidine Base Conversion Reaction (2024)
  • 著者名/発表者名: Sana Ohashi, Mayu Nakamura, Susit Acharyya, Masahito Inagaki, Naoko Abe, Yasuaki Kimura, Fumitaka Hashiya, Hiroshi Abe
  • 雑誌名: ACS Omega 巻: 14;9(8) 号: 8 ページ: 9300-9308
  • DOI: 10.1021/acsomega.3c08516
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The Association of Lung Function and Carotid Intima-Media Thickness in a Japanese Population: The Tohoku Medical Megabank Community-Based Cohort Study (2023)
  • 著者名/発表者名: Masato Takase, Mitsuhiro Yamada, Tomohiro Nakamura, Naoki Nakaya, Mana Kogure, Rieko Hatanaka, Kumi Nakaya, Ikumi Kanno, Kotaro Nochioka, Naho Tsuchiya, Takumi Hirata, Yohei Hamanaka, Junichi Sugawara, Tomoko Kobayashi, Nobuo Fuse, Akira Uruno, Eiichi N Kodama, Shinichi Kuriyama, Ichiro Tsuji, Atsushi Hozawa
  • 雑誌名: Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ 巻: 30 号: 8 ページ: 1022-1044
  • DOI: 10.5551/jat.63826
  • ISSN: 1340-3478, 1880-3873
  • 年月日: 2023-08-01
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Dynamic and static control of the off-target interactions of antisense oligonucleotides using toehold chemistry (2023)
  • 著者名/発表者名: Terada Chisato、Oh Kaho、Tsubaki Ryutaro、Chan Bun、Aibara Nozomi、Ohyama Kaname、Shibata Masa-Aki、Wada Takehiko、Harada-Shiba Mariko、Yamayoshi Asako、Yamamoto Tsuyoshi
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 14 号: 1 ページ: 7972-7972
  • DOI: 10.1038/s41467-023-43714-0
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Water‐Dispersible Carbon Nano‐Test Tubes as a Container for Concentrated DNA Molecules (2023)
  • 著者名/発表者名: Hoshikawa Yasuto、Kanno Yasuyuki、Tawata Hanako、Sagae Takuya、Ishii Takafumi、Imoto Shuhei、Hagihara Shinya、Wada Takehiko、Nagatsugi Fumi、Aziz Alex、Nishihara Hirotomo、Kyotani Takashi、Itoh Tetsuji
  • 雑誌名: Chemistry A European Journal 巻: 29 号: 53 ページ: 1-9
  • DOI: 10.1002/chem.202301422
  • 査読あり
• [雑誌論文] Unique Crosslinking Properties of Psoralen‐conjugated Oligonucleotides developed by Novel Psoralen N‐Hydroxysuccinimide Esters (2023)
  • 著者名/発表者名: Nakao Juki、Mikame Yu、Eshima Honoka、Yamamoto Tsuyoshi、Dohno Chikara、Wada Takehiko、Yamayoshi Asako
  • 雑誌名: ChemBioChem 巻: - 号: 15 ページ: 1-9
  • DOI: 10.1002/cbic.202200789
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] External Stimulation-Responsive Artificial Nucleic Acids: Peptide Ribonucleic Acid (PRNA)-Programmed Assemblies (2023)
  • 著者名/発表者名: Inagaki Masahito、Wada Takehiko
  • 雑誌名: Handbook of Chemical Biology of Nucleic Acids (Springer Nature) 巻: 3 ページ: 1-26
  • DOI: 10.1007/978-981-16-1313-5_93-1
  • ISBN: 9789811613135
  • 査読あり
• [雑誌論文] Sequential chiral induction between organic and inorganic supramolecular helical assemblies for the <i>in situ</i> formation of chiral carbon dots (2023)
  • 著者名/発表者名: Pranee Piyanan、Scalabre Antoine、Labrugere Christine、Ryu Naoya、Yano Akira、Hano Nanami、Talaga David、Okazaki Yutaka、Pouget Emilie、Nlate Sylvain、Bonhommeau Sebastien、Takafuji Makoto、Wada Takehiko、Ihara Hirotaka、Buffeteau Thierry、Bassani Dario M.、Oda Reiko
  • 雑誌名: Chemical Communications 巻: 59 号: 64 ページ: 9762-9765
  • DOI: 10.1039/d3cc02057f
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Establishing an Accurate and Sensitive In Vitro Drug Screening System for Human Adenovirus Infection with Human Corneal Cells (2023)
  • 著者名/発表者名: Mina Sasano, Hironori Hayashi, Kumi Kawaji, Emiko Usui, Eiich N Kodama.
  • 雑誌名: Virology 巻: 581 ページ: 34-38
  • DOI: 10.1016/j.virol.2023.02.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mental Health Problems among University Students under the Prolonged COVID-19 Pandemic in Japan: A Repeated Cross-Sectional Survey (2023)
  • 著者名/発表者名: Seto Moe、Usukura Hitomi、Kunii Yasuto、Hamaie Yumiko、Kodama Eiichi N.、Makino Yuko、Kinouchi Yoshitaka、Ito Chihiro、Ikeda Tadayoshi、Tomita Hiroaki
  • 雑誌名: The Tohoku Journal of Experimental Medicine 巻: 260 号: 1 ページ: 1-11
  • DOI: 10.1620/tjem.2023.J012
  • ISSN: 0040-8727, 1349-3329
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Circulating Extracellular Vesicle Levels in Patients with Coronavirus Disease 2019 Coagulopathy: A Prospective Cohort Study (2023)
  • 著者名/発表者名: Yudai Iwasaki, Yusuke Takei, Mitsuhiro Yamada, Shigekazu Sugino, Koji Saito, Tetsuji Aoyagi, Kengo Oshima, Hajime Kanamori, Hiroaki Baba, Kentarou Takei, Koichi Tokuda, Eichi N. Kodama, Tetsuro Kamo, Tadashi Kamio, Takehiko Kasai, Satoru Ogawa, Masanori Yamauchi.
  • 雑誌名: Journal of Clinical Medicine 巻: 12 号: 10 ページ: 3460-3460
  • DOI: 10.3390/jcm12103460
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Investigation of oral macrolide prescriptions in Japan using a retrospective claims database, 2013-2018 (2023)
  • 著者名/発表者名: Ide Satoshi、Ishikane Masahiro、Aoyagi Kensuke、Ono Akane、Asai Yusuke、Tsuzuki Shinya、Kusama Yoshiki、Gu Yoshiaki、Kodama Eiichi、Ohmagari Norio
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 18 号: 6 ページ: 27297-287297
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0287297
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] HIV-1 Resistance to Islatravir/Tenofovir Combination Therapy in Wild-Type or NRTI-Resistant Strains of Diverse HIV-1 Subtypes (2023)
  • 著者名/発表者名: Cilento Maria E.、Wen Xin、Reeve Aaron B.、Ukah Obiaara B.、Snyder Alexa A.、Carrillo Ciro M.、Smith Cole P.、Edwards Kristin、Wahoski Claudia C.、Kitzler Deborah R.、Kodama Eiichi N.、Mitsuya Hiroaki、Parniak Michael A.、Tedbury Philip R.、Sarafianos Stefan G.
  • 雑誌名: Viruses 巻: 15 号: 10 ページ: 1990-1990
  • DOI: 10.3390/v15101990
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] The risk of withdrawal from hypertension treatment in coastal areas after the Great East Japan Earthquake: the TMM CommCohort Study (2023)
  • 著者名/発表者名: Hatanaka Rieko、Nakaya Naoki、Kogure Mana、Nakaya Kumi、Chiba Ippei、Kanno Ikumi、Hashimoto Hideaki、Nakamura Tomohiro、Nochioka Kotaro、Obara Taku、Hamanaka Yohei、Sugawara Junichi、Kobayashi Tomoko、Uruno Akira、Kodama Eiichi N.、Fuse Nobuo、Kuriyama Shinichi、Hozawa Atsushi
  • 雑誌名: Hypertension Research 巻: 46 号: 12 ページ: 2718-2728
  • DOI: 10.1038/s41440-023-01454-0
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Identification of SARS-CoV-2 Mpro inhibitors containing P1’ 4-fluorobenzothiazole moiety highly active against SARS-CoV-2 (2023)
  • 著者名/発表者名: Higashi-Kuwata Nobuyo、Tsuji Kohei、Hayashi Hironori、Bulut Haydar、Kiso Maki、Imai Masaki、Ogata-Aoki Hiromi、Ishii Takahiro、Kobayakawa Takuya、Nakano Kenta、et al.
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 14 号: 1 ページ: 1076-1076
  • DOI: 10.1038/s41467-023-36729-0
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Design and Progress of Child Health Assessments at Community Support Centers in the Birth and Three-Generation Cohort Study of the Tohoku Medical Megabank Project (2023)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi T, Kobayashi M, Minegishi N, Kikuya M, Obara T, Ishikuro M, Yamanaka C, Onuma T, Murakami K, Ueno F, Noda A, Uruno A, Sugawara J, Suzuki K, Kodama EN, Hamanaka Y, Tsuchiya M, Kogure M, Nakaya N, Taira M, Sakurai-Yageta M, Tamahara T, Kawashima J, Goto M, Otsuki A, Shimizu R,Ogishima A,1, Hashizume H, et al.
  • 雑誌名: The Tohoku Journal of Experimental Medicine 巻: 259 号: 2 ページ: 93-105
  • DOI: 10.1620/tjem.2022.J103
  • ISSN: 0040-8727, 1349-3329
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Comprehensive Structural and Electronic Properties of 2-Azaadamantane N-Oxyl Derivatives Correlated with Their Catalytic Ability (2023)
  • 著者名/発表者名: Masaki Nishijima, Yusuke Sasano, Yoshiharu Iwabuchi, Yasuyuki Araki
  • 雑誌名: ACS Omega 巻: 8 号: 51 ページ: 49067-49072
  • DOI: 10.1021/acsomega.3c06902
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] The Novel Design Strategy of DNA-Artificial Nucleic Acid Chimera Toward Enhancement of RNase H Mediated RNA Cleavage Activities: Application for COVID-19 Therapeutics (2023)
  • 著者名/発表者名: TAKEHIKO WADA
  • 学会等名: The 6th Asian Chemical Biology Conference (ACBC-2023)
  • 国際学会 / 招待講演
• [産業財産権] キメラ人工核酸による触媒的核酸医薬 (2024)
  • 発明者名: 和田健彦
  • 権利者名: 和田健彦
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2024
  • 外国